一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及血红蛋白制备技术领域，具体公开了一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法。包括：1）将新鲜牛血用纯净水溶胀破壁，过滤出去固体杂质，得血红蛋白裂解原液；2）将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱；3）用洗杂液过柱清洗杂质；4）用洗脱液洗脱血红蛋白，收集，得血红蛋白洗脱液；5）将血红蛋白洗脱液通过超滤进行浓缩、脱盐，然后进行冻干，得血红蛋白产品；洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2

【技术实现步骤摘要】
一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及血红蛋白制备
，尤其是涉及一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法。

技术介绍

[0002]血红蛋白是红细胞内运输氧的特殊蛋白质，是血液呈红色的蛋白质，由珠蛋白、血红素组成，血红蛋白与红细胞的使用价值近似，通过检测血液中血红蛋白的含量，可判断人体生体健康程度，有较大的临床价值。
[0003]当人体血液中血红蛋白含量不足时，可以通过注射血红蛋白进行补充，其中牛血红蛋白是常用的血液替代用品，为了提高注射效果，需要制备高纯度的血红蛋白。
[0004]现有制备高纯度血红蛋白的方法主要有硫酸铵分级沉淀法和PEG沉淀法之后再上阴离子交换柱或凝胶柱，以上制备方法虽然能获得高纯度血红蛋白，但是会有大量硫酸铵、PEG的废液产生，容易对环境造成污染，因此，还有改善空间。

技术实现思路

[0005]为了使得提取高纯度血红蛋白时更为环保，本申请提供一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法。
[0006]本申请提供的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法采用如下的技术方案：一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1)，将新鲜牛血用纯净水溶胀破壁，过滤出去固体杂质，得血红蛋白裂解原液；步骤2)，将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱；步骤3)，用2
‑
4倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质；步骤4)，用洗脱液洗脱血红蛋白，收集，得血红蛋白洗脱液；步骤5)，将血红蛋白洗脱液通过超滤进行浓缩、脱盐，然后进行冻干，得血红蛋白产品；所述洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2
‑
吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配；所述洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。
[0007]通过采用上述技术方案，通过将新鲜牛血中的红细胞溶胀，然后过滤掉细胞膜等固体杂质后直接上柱吸附，利用铜离子熬合吸附柱中的铜离子与蛋白表面的组氨酸结合使得蛋白质吸附在树脂中，而其他杂质则跟随水流排出，实现蛋白质的初步分离，采用特殊的洗杂液过柱清洗，可将球蛋白、白蛋白等杂蛋白去除，再通过洗脱液将血红蛋白洗脱，除去洗脱液中的盐后即可获得高纯度血红蛋白，废液产生较少，树脂柱能重复使用，制备血红蛋白的工艺步骤简单，制备效率较高，较为环保，并且具有较高的经济价值。
[0008]通过洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2
‑
吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配，能很好地除去球蛋白、白蛋白等杂蛋白，并且对血红蛋白的洗脱效果极差，基本不会带出血红蛋白，使得目标产物血红蛋白在洗杂液的冲洗下依旧能很好地稳定附着在树脂柱中，实现了高纯度血红蛋白的制备的同时减少血红蛋白的消耗，产物收率较高，具有更高的经济价值。
[0009]优选的，所述洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.3
‑
0.4mol/L、磷酸钠浓度为0.01
‑
0.02mol/L、磷酸氢钾浓度为0.01
‑
0.02mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.5
‑
0.6mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.4
‑
0.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.7
‑
0.8mol/L、2
‑
吗啉乙磺酸浓度为0.03
‑
0.04mol/L、尿素浓度为0.3
‑
0.4mol/L。
[0010]通过采用上述技术方案，通过具体选择乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2
‑
吗啉乙磺酸、尿素的浓度，制得的洗杂液对球蛋白、白蛋白等杂蛋白的洗脱效果更佳，并且更不易洗脱血红蛋白，制得的血红蛋白的纯度较高的同时血红蛋白的损耗更少，收率更高，具有更高的经济价值。
[0011]优选的，所述洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01
‑
0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01
‑
0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.4
‑
0.5mol/L、咪唑的浓度为0.4
‑
0.5mol/L。
[0012]通过采用上述技术方案，通过具体选择磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑的浓度，洗脱血红蛋白的效果较佳，后续除盐时难度更低，工艺操作更为简单。
[0013]优选的，所述铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：步骤01)，将大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂水洗干净后装柱；步骤02)，用浓度为4
‑
6％的盐酸溶液过柱清洗；步骤03)，用纯净水过柱清洗至中性；步骤04)，用浓度为4
‑
6％的氢氧化钠溶液过柱清洗；步骤05)，用纯净水过柱清洗至中性；步骤06)，用浓度为0.4
‑
0.6mol/L的硫酸铜溶液上样至铜离子吸附饱和；步骤07)，用纯净水过柱清洗多余的铜离子；步骤08)，用平衡液过柱平衡，得铜离子螯合树脂柱；所述平衡液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、纯净水的复配。
[0014]通过采用上述技术方案，通过采用特殊工艺制得铜离子螯合树脂柱，对表面含有组氨酸的蛋白质的吸附效果较佳，在血红蛋白裂解原液上柱时，能有效吸附目标蛋白，减少血红蛋白在血红蛋白裂解原液上柱过程中的流失，有效提高血红蛋白的收率。
[0015]优选的，所述平衡液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01
‑
0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01
‑
0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.45
‑
0.55mol/L。
[0016]通过采用上述技术方案，通过具体选择磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠的浓度，制得的铜离子螯合树脂柱吸附带有组氨酸的蛋白质的效果更佳，更好地减少上样时血红蛋白的流失，具有更高的经济价值。
[0017]优选的，所述步骤08)中，采用3
‑
4倍柱体积的平衡液过柱平衡。
[0018]通过采用上述技术方案，通过具体选择平衡液过柱平衡的用量，制得的铜离子螯合树脂柱吸附血红蛋白的效果更好，减少上样过程中血红蛋白的流失，收率更高，具有更高的经济价值。
[0019]优选的，所述步骤02)中，采用2
‑
4倍柱体积的盐酸溶液过柱清洗。
[0020]通过采用上述技术方案，通过具体选择盐酸溶液酸洗的用量，制得的铜离子螯合树脂柱质量更佳，吸附血红蛋白的效果更好，更好地减少上样过程中血红蛋白的流失。
[0021]优选的，所述步骤04)中，采用2
‑
4倍柱体积的氢氧化钠溶液过柱清洗。
[0022]通过采用上述技术方案，通过具体选择氢氧化钠溶液碱洗的用量，制得的铜离子螯合树脂柱质量对血红蛋白的吸附效果更佳，更好地减本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1），将新鲜牛血用纯净水溶胀破壁，过滤出去固体杂质，得血红蛋白裂解原液；步骤2），将血红蛋白裂解原液上铜离子螯合树脂柱；步骤3），用2
‑
4倍柱体积的洗杂液过柱清洗杂质；步骤4），用洗脱液洗脱血红蛋白，收集，得血红蛋白洗脱液；步骤5），将血红蛋白洗脱液通过超滤进行浓缩、脱盐，然后进行冻干，得血红蛋白产品；所述洗杂液为乙二胺四乙酸、磷酸钠、磷酸氢钾、十二烷基磺酸钠、二硫苏糖醇、三羟甲基氨基甲烷、2
‑
吗啉乙磺酸、尿素、纯净水的复配；所述洗脱液为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、咪唑、纯净水的复配。2.根据权利要求1所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述洗杂液中，乙二胺四乙酸的浓度为0.3
‑
0.4mol/L、磷酸钠浓度为0.01
‑
0.02mol/L、磷酸氢钾浓度为0.01
‑
0.02mol/L、十二烷基磺酸钠浓度为0.5
‑
0.6mol/L、二硫苏糖醇浓度为0.4
‑
0.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷浓度为0.7
‑
0.8mol/L、2
‑
吗啉乙磺酸浓度为0.03
‑
0.04mol/L、尿素浓度为0.3
‑
0.4mol/L。3.根据权利要求1所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述洗脱液中，磷酸二氢钠的浓度为0.01
‑
0.02mol/L、磷酸氢二钠的浓度为0.01
‑
0.02mol/L、氯化钠的浓度为0.4
‑
0.5mol/L、咪唑的浓度为0.4
‑
0.5mol/L。4.根据权利要求1所述的一种铜离子螯合树脂固相吸附制备高纯度血红蛋白的方法，其特征在于：所述铜离子螯合树脂柱的制备方法如下：步骤01），将大孔螯合型亚胺乙酸基螯合树脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长路，刘爱香，
申请(专利权)人：广州蕊特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：