一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法，具体包括以下步骤：S1、mPEG的制备：将PEG原料加入反应设备中，再将羧甲基化单甲氧基反应物也加入反应设备中，通过搅拌设备以转速为4000

【技术实现步骤摘要】
一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体为一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法。

技术介绍

[0002]血红蛋白(Hb)是红细胞的主要组成，红细胞携带氧从肺贯穿全身。当包含在红细胞中时，Hb以两个氧连接的αβ二聚物组成的四聚体结构存在，每个二聚物的分子量大约为32Kd。每个二聚物的每个α和β亚基都具有蛋白链和血红素分子。α和β蛋白链的序列是已知的。Hb是一种用于输血的可能有用的血液代用品，而且已经提出用作感染性休克中捕捉氧化亚氮，以及在癌症的放射治疗中调节组织的氧合作用的试剂。重组DNA技术能生产修饰的Hb，其具有调节用于个别治疗应用的特殊需要的氧亲和力，蚯蚓血红蛋白也称为蚯蚓胞外巨大血红蛋白，是广泛存在于蚯蚓体内的一种氧载体蛋白。根据目前的研究得知，其单体结构与人血血红蛋白的单体结构非常相似，且具有更强的氧气的携带运输能力。因此，作为一种重要的、潜在的新型血液替代品受到科学界的关注。
[0003]目前的蚯蚓血红蛋白在修饰使用的过程中，由于修饰剂溶解释放过快导致蚯蚓血红蛋白修饰不充分，不能实现通过降低修饰剂在反应介质中的溶解释放速度，来使蚯蚓血红蛋白能够进行更加充分的修饰处理，无法达到既方便又充分的对蚯蚓血红蛋白进行修饰的目的，从而给人们的使用带来极大的不便。

技术实现思路

[0004](一)解决的技术问题
[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法，解决了现有的蚯蚓血红蛋白在修饰使用的过程中，由于修饰剂溶解释放过快导致蚯蚓血红蛋白修饰不充分，不能实现通过降低修饰剂在反应介质中的溶解释放速度，来使蚯蚓血红蛋白能够进行更加充分的修饰处理，无法达到既方便又充分的对蚯蚓血红蛋白进行修饰目的的问题。
[0006](二)技术方案
[0007]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法，具体包括以下步骤：
[0008]S1、mPEG的制备：将PEG原料加入反应设备中，再将羧甲基化单甲氧基反应物也加入反应设备中，通过搅拌设备以转速为4000
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6000rpm，温度为8
‑
13℃的条件下混合反应30
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40min，反应结束后得到羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG；
[0009]S2、mPEG的活化：将步骤S1得到的羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG通过加入活化剂进行活化处理：
[0010]S3、蚯蚓血红蛋白的制备：选取人工饲养的蚯蚓，先吐沙干净后冲洗3
‑
5次，再剪成0.3
‑
1.2cm的小段，放入提取设备中，依次经过溶解、离心和提取处理后，得到蚯蚓血红蛋白提取液；
[0011]S4、蚯蚓血红蛋白巯基化处理：将步骤S3制得的蚯蚓血红蛋白提取液与亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化蚯蚓血红蛋白Hb；
[0012]S5、蚯蚓血红蛋白的修饰：使用离子交换介质辅助修饰，将步骤S4巯基化的分子内交联蚯蚓血红蛋白Hb和步骤S2活化好的羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG依次加入到反应介质中在反应设备内反应，先使巯基化的分子内交联蚯蚓血红蛋白Hb悬浮于反应介质中，再加入羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG，使羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG缓释，从而使巯基化的蚯蚓血红蛋白Hb与羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG的官能团反应，以形成修饰的蚯蚓血红蛋白Hb；
[0013]S6、洗脱分析：经过步骤S5反应完成后对体系进行洗脱，并收集蛋白峰进行分析。
[0014]优选的，所述步骤S1中PEG原料是采用型号为mPEG5000反应原料。
[0015]优选的，所述步骤S4中加入亚氨基四氢噻吩的体积为蚯蚓血红蛋白提取液的2
‑
5倍。
[0016]优选的，所述步骤S4中巯基化反应温度为10
‑
20℃，反应时间为6
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10min。
[0017]优选的，所述步骤S5中反应介质为马来酰亚胺，且加入的体积为巯基化的蚯蚓血红蛋白Hb的10
‑
13倍。
[0018]优选的，所述步骤S5中反应温度为25
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35℃，反应时间为40
‑
45min。
[0019]优选的，所述步骤S5中反应设备是采用智能化控制的缓释反应器。
[0020]优选的，所述步骤S6中蛋白峰分析是采用阳离子交换层析法进行分离分析处理。
[0021](三)有益效果
[0022]本专利技术提供了一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法，具体包括以下步骤：S1、mPEG的制备：将PEG原料加入反应设备中，再将羧甲基化单甲氧基反应物也加入反应设备中，通过搅拌设备以转速为4000
‑
6000rpm，温度为8
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13℃的条件下混合反应30
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40min，反应结束后得到羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG；S2、mPEG的活化：将步骤S1得到的羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG通过加入活化剂进行活化处理：S3、蚯蚓血红蛋白的制备：选取人工饲养的蚯蚓，先吐沙干净后冲洗3
‑
5次，再剪成0.3
‑
1.2cm的小段，放入提取设备中，依次经过溶解、离心和提取处理后，得到蚯蚓血红蛋白提取液；S4、蚯蚓血红蛋白巯基化处理：将步骤S3制得的蚯蚓血红蛋白提取液与亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化蚯蚓血红蛋白Hb；S5、蚯蚓血红蛋白的修饰：使用离子交换介质辅助修饰，将步骤S4巯基化的分子内交联蚯蚓血红蛋白Hb和步骤S2活化好的羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG依次加入到反应介质中在反应设备内反应，先使巯基化的分子内交联蚯蚓血红蛋白Hb悬浮于反应介质中，再加入羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG，使羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG缓释，从而使巯基化的蚯蚓血红蛋白Hb与羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG的官能团反应，以形成修饰的蚯蚓血红蛋白Hb；S6、洗脱分析：经过步骤S5反应完成后对体系进行洗脱，并收集蛋白峰进行分析，可实现通过降低修饰剂在反应介质中的溶解释放速度，来使蚯蚓血红蛋白能够进行更加充分的修饰处理，很好的达到了既方便又充分的对蚯蚓血红蛋白进行修饰的目的，避免由于修饰剂溶解释放过快导致蚯蚓血红蛋白修饰不充分的情况发生，从而大大方便了人们的使用。
附图说明
[0023]图1为本专利技术修饰方法的流程图。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]请参阅图1，本专利技术实施例提供三种技术方案：一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PEG修饰蚯蚓血红蛋白的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、mPEG的制备：将PEG原料加入反应设备中，再将羧甲基化单甲氧基反应物也加入反应设备中，通过搅拌设备以转速为4000
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6000rpm，温度为8
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13℃的条件下混合反应30
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40min，反应结束后得到羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG；S2、mPEG的活化：将步骤S1得到的羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG通过加入活化剂进行活化处理：S3、蚯蚓血红蛋白的制备：选取人工饲养的蚯蚓，先吐沙干净后冲洗3
‑
5次，再剪成0.3
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1.2cm的小段，放入提取设备中，依次经过溶解、离心和提取处理后，得到蚯蚓血红蛋白提取液；S4、蚯蚓血红蛋白巯基化处理：将步骤S3制得的蚯蚓血红蛋白提取液与亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化蚯蚓血红蛋白Hb；S5、蚯蚓血红蛋白的修饰：使用离子交换介质辅助修饰，将步骤S4巯基化的分子内交联蚯蚓血红蛋白Hb和步骤S2活化好的羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG依次加入到反应介质中在反应设备内反应，先使巯基化的分子内交联蚯蚓血红蛋白Hb悬浮于反应介质中，再加入羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG，使羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG缓释，从而使巯基化的蚯蚓血红蛋白Hb与羧甲基化单甲氧基聚乙二醇mPEG的官能团反应，以形成修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣龙，余春红，任烽，陈露，金怡杉，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：