人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法，该前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系为JEI

Immortalized cell line of human vestibular schwannoma and its construction method

【技术实现步骤摘要】
人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法


[0001]本专利技术属于细胞
，具体涉及一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法。

技术介绍

[0002]JEI
‑
002是培养散发性前庭神经鞘膜瘤(sporadic Vestibular Schwannoma,sVS)患者肿瘤细胞而建立的稳定人源细胞系。
[0003]前庭神经鞘膜瘤是起源于前庭神经鞘膜细胞的良性肿瘤，其生长于桥小脑角区域，瘤体逐渐增大会压迫周围颅神经和脑组织，从而产生听力下降、耳鸣、眩晕、面瘫等相应临床症状，甚至威胁患者生命。其病因分为两种，散发性前庭神经鞘膜瘤和神经纤维瘤病2型(neurofibromatosis type2,NF2)，后者为家族遗传性罕见病。根据国外大规模病例的长期临床随访观察，不同听神经瘤的临床生物学行为之间呈现较大的差异性，大约半数肿瘤能持续生长，另有半数肿瘤生长出现静止甚至缩小。前庭神经鞘膜瘤临床生物学行为的差异性，可决定对其采用不同的治疗方案。目前，在对前庭神经鞘膜瘤的机制探索中仍然存在很多未知。
[0004]在此机制探索的过程中举步维艰，很大一部分原因是因为没有相应的细胞系。细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。细胞系为在探索机制的体外实验阶段中提供了操作更方便、生长速度更快、性质更较稳定的实验对象；同时也为动物肿瘤等体内实验提供了良好的实验基础。而现有与听神经瘤相关的细胞系只有两类，一是实验动物来源的听神经瘤细胞，如RT4
‑r/>D6P2T，为大鼠来源的神经雪旺细胞；二是HEI193，为人神经鞘膜瘤细胞，是1999年Gene Hung团队取自NF2病患者培养的细胞系。故JEI
‑
002是一株人源的取自于散发性前庭神经鞘膜瘤患者的细胞系。为今后的前庭神经鞘膜瘤的机制研究提供了物质基础和研究平台。
[0005]缺点：不同个体的同一种肿瘤存在差异性，即JEI
‑
002只能代表此患者前庭神经鞘膜瘤其自身的特点，系所有细胞系所共同的特点。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的不足，本专利技术的目的是提供一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法。
[0007]培养人源神经鞘膜瘤永生化细胞系JEI
‑
002主要原理：
[0008]通过体外培养散发性前庭神经鞘膜瘤细胞获得神经鞘膜瘤原代细胞，并利用慢病毒转染技术过表达细胞内的SV40基因，使其获得永生化的特性，即克服了良性肿瘤增殖能力有限的特性，为体内体外实验提供细胞载体基础。
[0009]为达到上述目的，本专利技术的解决方案是：
[0010]第一方面，本专利技术提供了一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系，该细胞系为JEI
‑
002，其源于临床患者前庭神经鞘膜瘤组织，帮助提供前庭神经鞘膜瘤体外研究基础。
[0011]第二方面，本专利技术提供了一种上述的人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系的构建方法，其包括如下步骤：
[0012](1)分离培养前庭神经鞘膜瘤细胞；
[0013](2)进行免疫荧光鉴定；
[0014](3)利用慢病毒转染技术过表达细胞内的SV40基因；
[0015](4)利用嘌呤霉素筛选转染的细胞；
[0016](5)将筛选后的细胞进行扩增，并对JEI
‑
002进行细胞鉴定。
[0017]优选地，步骤(2)中，免疫荧光鉴定的过程包括细胞爬片、固定、破膜封闭、孵育和包埋。
[0018]优选地，步骤(3)中，转染技术过程中，载体的目的序列如SEQ ID NO.1所示。
[0019]优选地，步骤(4)中，嘌呤霉素筛选转染的细胞时，嘌呤霉素的浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL和7μg/mL。
[0020]优选地，步骤(5)中，细胞鉴定的过程中，对JEI
‑
002使用免疫细胞化学的方法，染色细胞特异标记蛋白，进行鉴定。
[0021]由于采用上述方案，本专利技术的有益效果是：
[0022]JEI
‑
002是一株人源的取自于散发性前庭神经瘤患者的细胞系，提供了不同前庭神经鞘膜瘤细胞，为今后的前庭神经鞘膜瘤的机制研究提供了多样的物质基础和研究平台。
附图说明
[0023]图1为本专利技术的实施例1中细胞培养图。
[0024]图2为本专利技术的实施例2中鉴定结果图。
[0025]图3为本专利技术的实施例3中载体图谱。
[0026]图4为本专利技术的实施例3中细胞转染图。
[0027]图5为本专利技术的实施例5中永生化的细胞图。
[0028]图6为本专利技术的实施例6中Sanger测序图。
具体实施方式
[0029]本专利技术提供了一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法。
[0030]培养人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系JEI
‑
002主要步骤
[0031]实施例1：
[0032]一、人源前庭神经鞘膜瘤细胞的分离培养
[0033]1、实验试剂：
[0034](1)完全培养基：DMEM高糖+1
×
N2添加剂+Insulin 5μg/mL+10％FBS+1
×
青霉素/链霉素溶液(P/S)；
[0035](2)基础培养基：DMEM高糖；
[0036](3)缓冲液：无菌不含Ca
2+
和Mg
2+
的1
×
PBS+1
×
P/S，pH＝7.4；
[0037](4)消化液：0.125％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶；
[0038](5)包被液：无菌层粘连蛋白(Laminin)10μg/mL 1
×
PBS溶解；
[0039](6)75％医用酒精；
[0040](7)胎牛血清(FBS)。
[0041]2、分离培养
[0042](1)将手术中取出的前庭神经鞘膜瘤组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输；
[0043](2)在超净工作台内取出组织，用75％酒精浸泡2min左右，置于含有P/S的PBS中；
[0044](3)将组织块剪成边长约为0.1cm的正方形，反复清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30
‑
60min；
[0045](4)用镊子夹入培养瓶中，倒置于5％CO2培养箱中孵育2h；
[0046](5)分别加入2mL肿瘤细胞完全培养基，浸润组织块，但不能使组织块漂浮，置于5％CO2细胞培养箱中；
[0047](6)每隔3天换液，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶。细胞培养图片如图1所示，表明细胞形态特征。
[0048]实施例2：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系，其特征在于：该细胞系为JEI
‑
002。2.一种根据权利要求1所述的人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系的构建方法，其特征在于：其包括如下步骤：(1)分离培养前庭神经鞘膜瘤细胞；(2)进行免疫荧光鉴定；(3)利用慢病毒转染技术过表达细胞内的SV40基因；(4)利用嘌呤霉素筛选转染的细胞；(5)将筛选后的细胞进行扩增，并对JEI
‑
002进行细胞鉴定。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，所述免疫荧光鉴定的过程包括细胞爬片、固定、破...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴皓，汪照炎，薛璐，何维维，舒文莹，王耀萱，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：