一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明专利技术以MMP2基因以及转录因子ESR1为研究对象，通过利用分子生物学、细胞生物学等技术，构建转录因子ESR1的超表达载体并设计其干扰片段，研究转录因子ESR1对MMP2基因表达的影响。本发明专利技术技术方案设计周详，结果可靠。转录因子ESR1可以结合于MMP2基因启动子(

【技术实现步骤摘要】
一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法


[0001]本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法。

技术介绍

[0002]基因表达是指基因通过转录和翻译将基因含有的遗传信息转变为RNA、多肽和蛋白质的过程。基因5
’
非翻译区存在着很多调控元件，包括内部核糖体进入位点、5
’
UTR二级结构、G
‑
四聚体、5
’
帽子结构、上游起始密码子ATG和5'UTR内含子等，5
’
UTR在基因表达调控中维持mRNA的稳定性、核内运输、RNA剪接和细胞增殖等都有一定作用。
[0003]基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinases 2，MMP2)是MMPs家族的重要成员之一，能分解卵泡液中的明胶蛋白、纤维蛋白和IV型胶原蛋白，影响颗粒细胞的增殖、凋亡。在闭锁卵泡中，MMP2基因mRNA的表达水平显著高于在正常卵泡中的表达水平。

技术实现思路

[0004]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法，采用转录因子ESR1作为MMP2基因启动子区的转录因子，通过调节转录因子ESR1的表达水平，实现猪卵巢颗粒细胞中MMP2基因转录活性的调控。
[0007]进一步地，所述的转录因子ESR1通过结合在MMP2基因启动子
‑
1317～
‑
1274bp区域抑制其表达；增加外源性转录因子ESR1，MMP2基因转录活性降低；抑制转录因子ESR1表达，MMP2基因转录活性升高。
[0008]更进一步地，所述的增加外源性转录因子ESR1通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：(1)提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；(2)将目的片段连接到用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
[0009]步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
[0010][0011][0012]注：下划线部分为保护碱基，斜体部分为酶切位点。
[0013]更进一步地，所述的抑制转录因子ESR1表达通过RNA干扰技术实现，采用的siRNA为如下序列如下：
[0014]siRNA
‑
ESR1
‑
2：5
′‑
GGATTTAAGCCTCCATGAT
‑3′
。
[0015]一种卵巢颗粒细胞MMP2基因的核心启动子功能调节区，为MMP2基因启动子
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1317～
‑
1274bp区域。
[0016]一种调控卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的核酸片段，为抑制转录因子ESR1表达的siRNA，所述siRNA为如下序列如下：
[0017]siRNA
‑
ESR1
‑
2：5
′‑
GGATTTAAGCCTCCATGAT
‑3′
。
[0018]上述核心启动子功能调节区或上述核酸片段在调控卵巢颗粒细胞MMP2基因表达中的应用。
[0019]本专利技术前期通过生物信息学网站预测到MMP2启动子区存在雌激素受体1(Estrogen receptor 1，ESR1)的结合位点。ESR1是转录因子核受体家族的重要成员之一，ESR1在无激素的情况下处于不活跃状态，与雌激素结合后，ESR1会变成同源二聚体，接着通过与基因启动子结合的调控元件相互作用，进而调控基因转录水平，也可以通过接收传递E2发出的信号和调节E2信号通路关键基因的表达调节哺乳动物生殖系统的发育成熟。综上所述，转录因子ESR1可能结合于MMP2启动子区并调控MMP2的表达，进而影响颗粒细胞的功能。
[0020]本专利技术的验证结果如下：
[0021]1、通过生物信息学网站预测转录因子ESR1在MMP2基因启动子区(
‑
2142/+1，+1为转录起始位点)潜在的结合位点，MMP2基因启动子区存在6个ESR1的结合位点，分别位于：
‑
2078/
‑
2071bp、
‑
2060/
‑
2053bp、
‑
1317/
‑
1310bp、
‑
1274/
‑
1267bp、
‑
406/
‑
399bp、
‑
392/
‑
385bp(图1)。
[0022]2、我们根据转录因子ESR1在MMP2基因启动子区的结合位点，构建MMP2基因启动子缺失片段的重组质粒(P1～P4)，转染至颗粒细胞后，利用多功能酶标仪检测MMP2基因启动子缺失片段的相对活性，发现MMP2基因启动子缺失片段载体P3的活性极显著高于P2(P<0.001)，而重组载体P4的活性极显著低于P3(P<0.001)(图1)。
[0023]3、设计扩增转录因子ESR1 CDS区的引物：从NCBI上查找转录因子ESR1(NCBI Gene ID:397435)的序列，确定酶切位点(ESR1的酶切位点是EcoRI和XbaI)，使用NCBI网站设计特异性引物；通过PCR特异性扩增、纯化、酶切目的片段，然后连接至pcDNA3.1表达载体，最后成功构建ESR1的超表达载体pcDNA3.1
‑
ESR1。后续通过在颗粒细胞中转染不同浓度(100、400和800ng)的超表达载体，qRT
‑
PCR检测ESR1 mRNA的表达水平，发现转染pcDNA3.1
‑
ESR1超表达载体的浓度越高，ESR1 mRNA的表达水平越高，且均差异显著。在颗粒细胞中转染400ng ESR1超表达载体，利用Western Blot检测ESR1蛋白的表达水平，发现与对照组相比，转染ESR1超表达载体后，ESR1蛋白的表达水平显著升高(图2)。证明构建的ESR1超表达载体可以在颗粒细胞中正常表达，后续研究选择400ng为pcDNA3.1
‑
ESR1的转染浓度。
[0024]4、合成3对干扰ESR1的小干扰RNA/对照(ESR1
‑
siRNA/siRNA
‑
NC)，后续在颗粒细胞中转染不同浓度(30nmol、50nmol和100nmol)的小干扰RNA，通过qRT
‑
PCR检测其干扰效率。由附图结果可知，ESR1
‑
siRNA
‑
2小干扰RNA的干扰效果最好，然后在颗粒细胞中转染50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控猪卵巢颗粒细胞MMP2基因表达的方法，其特征在于：采用转录因子ESR1作为MMP2基因启动子区的转录因子，通过调节转录因子ESR1的表达水平，实现猪卵巢颗粒细胞中MMP2基因转录活性的调控。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的转录因子ESR1通过结合在MMP2基因启动子
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1317～
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1274bp区域抑制其表达；增加外源性转录因子ESR1，MMP2基因转录活性降低；抑制转录因子ESR1表达，MMP2基因转录活性升高。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的增加外源性转录因子ESR1通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：(1)提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；(2)将目的片段连接到用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中进行PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓龙，李泳光，李加琪，吕媛媛，方明，张哲，张豪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：