筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用技术

本发明专利技术公开了一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用。所述的筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型，采用Flp

【技术实现步骤摘要】
筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用


[0001]本专利技术涉及药物毒理学
，具体涉及一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型及其构建方法、应用。

技术介绍

[0002]外源化合物代谢毒性是指外源化合物本身没有毒性或毒性较低，经过机体的代谢会产生毒性更强的的中间代谢物或副产物对机体造成损害，称之为代谢毒性(或代谢损伤)，如黄曲霉素、苯并芘、对乙酰氨基酚等外源化合物均通过细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)超家族代谢生成致毒甚至致癌的代谢物发挥毒性作用。CYP是介导外源化合物代谢毒性的主要代谢酶之一，CYP3A4是成人肝脏表达量最高也是参与外源化合物代谢最多的CYP亚型。目前对代谢毒性的评价手段大多是将整体动物脏器损伤结果和基因/蛋白
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代谢物结合物作为外源化合物发育毒性的衡量指标，但存在动物用量大、检测方法要求高、灵敏度低等缺点，而已有的外源化合物代谢毒性的体外评价体系，如HepaRG或肝瘤细胞系，前者价格昂贵且不能传代，后者因代谢酶基础表达低需转染随机插入CYP的DNA序列，影响不同时期不同实验室的检测重复性。综上，外源化合物代谢毒性体外评价体系存在较大局限，灵敏度高、成本低、重复性好的外源化合物代谢毒性体外评价体系尚待开发。
[0003]Flp
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In
TM
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CHO细胞系来源于赛默飞世尔科技公司(货号:R75807)，在转录活性基因组基因座处包含一个稳定整合的FRT位点。构建含有CYP3A4编码DNA序列的Flp
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In
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表达载体和Flp
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In重组酶载体pOG44共转染Flp
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In
TM
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CHO，可以在每个细胞中将CYP3A4表达载体靶向整合到同一个位点中，确保不同时期或不同实验室都能得到均一CYP3A4表达水平的细胞模型。文献报道的其它类似代谢毒性评价细胞模型体系是否表达POR也并不清楚。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的之一在于提供一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性的外源化合物的细胞模型，所用细胞为Flp
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In
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CHO细胞系来源于赛默飞世尔科技公司(货号：R75807)，来自于中国仓鼠卵巢，不涉及复杂伦理问题并可多次传代，转录活性基因组基因座处包含一个稳定整合的FRT位点，可以在每个细胞中将CYP3A4表达载体靶向整合到同一个位点中。共转染POR后可极大提高对经CYP3A4介导代谢毒性的外源化合物的敏感性。所述模型以细胞活力为检测指标，是一个方法简单、成本低、敏感、快速的检测模型。
[0005]本专利技术目的之二在于提供一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性的外源化合物的细胞模型的构建方法，所述造模方法简单，可重复性强。
[0006]本专利技术目的之三在于提供一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性的外源化合物的细胞模型在检测具有代谢毒性的外源化合物中的应用，所述模型检测过程快速，应用范围广，可用于高通量筛选。
[0007]本专利技术实现目的之一采用以下技术方案：
[0008]一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型，其特征在于：采用Flp
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In
TM
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CHO作为目的细胞，将含有CYP3A4和POR的编码DNA序列分别转染入目的细胞，得到所述筛选成人代谢毒性外源化合物的细胞模型。
[0009]作为优选方案，所述筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型具有两个指标，细胞活力和半数抑制浓度(IC
50
)。
[0010]本专利技术实现目的之二采用以下技术方案：
[0011]一种如上所述的筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0012]S1：在基础培养基中复苏Flp
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In
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CHO细胞，所述基础培养基含10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的F12；
[0013]S2：构建含CYP3A4编码DNA序列的pcDNA5质粒；
[0014]S3：构建含POR编码DNA序列的pCMV质粒；
[0015]S4：将步骤S2构建的含CYP3A4编码DNA序列的pcDNA5质粒稳定转染入步骤S1传代后的Flp
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In
TM
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CHO中，在筛选DMEM/F12
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1培养基中培养，所述筛选DMEM/F12
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1培养基含10％胎牛血清和500μg/ml潮霉素的F12；
[0016]S5：将步骤S3构建的含POR编码DNA序列的pCMV质粒稳定转染入步骤S4得到的Flp
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In
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CHO
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CYP3A4细胞中，在筛选DMEM/F12
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2培养基中培养，所述筛选DMEM/F12
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2培养基含10％胎牛血清、500μg/ml潮霉素和50μg/ml嘌呤霉素的F12，得到所述筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型。
[0017]本专利技术实现目的之三采用以下技术方案：
[0018]一种如上述筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型在筛选具有代谢毒性的外源化合物中的应用。
[0019]作为优选方案，当细胞活力降低时，则提示所述待筛选外源化合物具有经CYP3A4介导的代谢毒性。
[0020]进一步地，根据不同待筛选外源化合物的IC
50
值能对不同外源化合物代谢毒性进行比较。
[0021]与现有的技术相比，本专利技术具有以下优点及有益效果：
[0022]本专利技术首次发现Flp
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In
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CHO缺乏人细胞色素P450氧化还原酶(EC 1.6.2.4；NADPH
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Cytochrome P450 Oxidoreductase；POR)表达，它是唯一的传递电子给CYP酶系以帮助完成CYP氧化功能的辅酶。本专利技术提出，将POR稳定转染入表达CYP3A4的Flp
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In
TM
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CHO中，可极大提高经CYP3A4介导的外源化合物代谢毒性筛选细胞模型的灵敏性。具体优点如下：
[0023]1、本专利技术提供的筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型与其他代谢毒性体外筛选系统相比，所用Flp
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In
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CHO
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3A4
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POR细胞具有以下优势：
①
细胞来源于中国仓鼠卵巢，不涉及复杂伦理问题；
②
无CYP3A4基础表达和诱导表达，需重组表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型，其特征在于：采用Flp
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In
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CHO作为目的细胞，将含有CYP3A4和POR的编码DNA序列分别转染入目的细胞，得到所述筛选成人代谢毒性外源化合物的细胞模型。2.如权利要求1所述的筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型，其特征在于：所述筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型具有两个指标，细胞活力和半数抑制浓度(IC
50
)。3.一种如权利要求1所述的筛选经CYP3A4介导代谢毒性外源化合物的细胞模型构建方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：在基础培养基中复苏Flp
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In
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CHO细胞，所述基础培养基含10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素的F12；S2：构建含CYP3A4编码DNA序列的pcDNA5质粒；S3：构建含POR编码DNA序列的pCMV质粒；S4：将步骤S2构建的含CYP3A4编码DNA序列的pcDNA5质粒稳定转染入步骤S1传代后的Flp
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CHO中，在筛选DMEM/F12
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1培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭喻，汪晖，龚正，胡文，孙潇翔，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：