使用环状DNA将抗原特异性受体基因导入至T细胞基因组的方法技术

本发明专利技术提供将编码抗原受体的核酸导入靶标生物的免疫细胞所含的核酸中的规定部位的技术。在本发明专利技术的技术中，将包含编码抗原受体的核酸的载体和核酸酶导入至免疫细胞，核酸酶切断载体及免疫细胞的基因组序列，载体能够以如下方式构成：在该载体被核酸酶切断时，产生编码抗原受体的序列，该序列通过微同源介导的末端接合(MMEJ)被导入至免疫细胞的基因组序列的被核酸酶切断的部位。列的被核酸酶切断的部位。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用环状DNA将抗原特异性受体基因导入至T细胞基因组的方法


[0001]本专利技术涉及免疫细胞的生物工程学上的操作。特别是，涉及将所期望的抗原受体导入至免疫细胞的技术。

技术介绍

[0002]目前，作为对于恶性肿瘤的新治疗手段，正在急速地开展导入有嵌合型抗原受体(CAR)的T细胞(CAR
‑
T)、导入有T细胞受体的T细胞(TCR
‑
T)的开发，在制作上述T细胞时使用了病毒载体或转位子载体。这些技术不能特定出供体基因插入区域，在安全性的方面尚有顾虑。另一方面，未确立利用环状DNA载体来制作针对恶性肿瘤的基因改变T细胞的技术，通过以往的方法导入环状双链DNA载体时的细胞存活率显著低。

技术实现思路

[0003]用于解决技术问题的技术手段
[0004]在本专利技术中，提供一种技术，其中，与核酸酶并用，使用环状DNA载体能够将任意的抗原受体(例如人T细胞受体(TCR)α链及β链基因、嵌合抗原受体(CAR))插入至免疫细胞的基因组上的所期望的区域。另外，提供使用该技术来制作插入有所期望的抗原特异性基因的医疗用基因组编集T细胞的技术。
[0005]另外，在本专利技术中，可提供将T细胞的基因组上的靶标区域用人工核酸酶切断、在DNA修复时准确地插入至切断序列间、可实现以下作用的环状双链DNA载体：1)能够使导入有载体的细胞持续地表达包含TCRα链及TCRβ链的所期望的TCR复合体或嵌合抗原受体(CAR)；并且2)仅通过采用特定限制酶的加工，能够置换为所期望表达的任意的TCRα链
·
TCRβ链序列或嵌合抗原受体(CAR)。
[0006]在本专利技术中，可提供将编码抗原受体的核酸导入靶标生物的免疫细胞所含的核酸中的规定部位的方法，所述方法包括将包含编码抗原受体的核酸的载体和核酸酶导入该免疫细胞的工序。核酸酶可切断载体及免疫细胞的基因组序列。而且，载体能够以如下方式构成：在其被核酸酶切断时，会产生编码抗原受体的序列，该序列通过微同源介导的末端接合(MMEJ)被导入至免疫细胞的基因组序列的被核酸酶切断的部位。在本专利技术的一个方面，可提供能够通过MMEJ进行基因导入的载体。在本专利技术的一个方面，可提供适合在该技术中使用的核酸酶。
[0007]作为本专利技术的实施方式，可列举例如以下的项目。
[0008](项目1)一种方法，其是将编码抗原受体的核酸导入靶标生物的免疫细胞所含的核酸中的规定部位的方法，
[0009]所述方法包括将载体和核酸酶导入至该免疫细胞的工序，所述载体包含该编码抗原受体的核酸，
[0010]该核酸酶切断该载体及该免疫细胞的基因组序列，
[0011]该载体以如下方式构成：在其被该核酸酶切断时，会产生编码该抗原受体的序列，该序列通过微同源介导的末端接合(MMEJ)被导入至该免疫细胞的基因组序列的被该核酸酶切断的部位。
[0012](项目2)根据上述项目所述的方法，其中，上述核酸酶切断上述免疫细胞的内源性抗原受体的基因座。
[0013](项目3)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述免疫细胞的内源性抗原受体基因的敲除与上述抗原受体的导入同时发生。
[0014](项目4)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述内源性抗原受体基因为TRA基因。
[0015](项目5)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述内源性抗原受体基因为TRB基因。
[0016](项目6)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，编码上述抗原受体的核酸编码上述抗原受体的α链及β链。
[0017](项目7)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述导入的工序使用电穿孔来进行。
[0018](项目8)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，在用CD3/CD28珠粒刺激免疫细胞后在约48～约72小时的期间进行上述导入的工序。
[0019](项目9)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述抗原受体选自T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)及嵌合抗原受体(CAR)。
[0020](项目10)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸酶将TRA基因的恒定区内进行切断。
[0021](项目11)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸酶将TRB基因的恒定区内进行切断。
[0022](项目12)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸酶为Cas9核酸酶。
[0023](项目13)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸酶为同源二聚体型的核酸酶，上述载体为环状载体。
[0024](项目14)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸酶为TALEN。
[0025](项目15)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，上述核酸酶为铂TALEN。
[0026](项目16)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，
[0027]上述核酸酶包含DNA结合域，
[0028]该DNA结合域自N末端侧起连续地包含多个DNA结合模块，自N末端起第4n
‑
3个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，
[0029]自N末端起第4n
‑
2个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，
[0030]自N末端起第4n
‑
1个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，
[0031]自N末端起第4n个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，
[0032]自N末端起第4n
‑
3个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合、自
N末端起第4n
‑
2个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合、自N末端起第4n
‑
1个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合、以及及自N末端起第4n个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合互不相同，
[0033]此处，n为1～10的自然数，x为1～40的自然数，y为1～40的自然数，x和y是不同的自然数。
[0034](项目17)根据上述项目中任一项所述的方法，其中，
[0035]上述载体通过上述核酸酶而产生核酸片段，所述核酸片段在从5
’
末端至3
’
末端的方向上依次包括包含第一核苷酸序列的区域、上述所期望的核酸、以及包含第二核苷酸序列的区域，
[0036]此处，上述细胞所含的核酸在从5
’
末端至3
’
末端的方向上依次包括包含第一核苷酸序列的区域、上述规定部位、以及包含第二核苷酸序列的区域，
[0037]上述细胞所含的核酸中的第一核苷酸序列与上述载体中的第一核苷酸序列通过微同源介导性接合来连接，上述细胞所含的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种方法，其是将编码抗原受体的核酸导入靶标生物的免疫细胞所含的核酸中的规定部位的方法，所述方法包括将载体和核酸酶导入至该免疫细胞的工序，所述载体包含编码该抗原受体的核酸，该核酸酶切断该载体及该免疫细胞的基因组序列，该载体以如下方式构成：在该载体被该核酸酶切断时，产生编码该抗原受体的序列，所述序列通过微同源介导的末端接合(MMEJ)被导入至该免疫细胞的基因组序列的被该核酸酶切断的部位。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸酶切断所述免疫细胞的内源性抗原受体的基因座。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫细胞的内源性抗原受体基因的敲除与所述抗原受体的导入同时发生。4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述内源性抗原受体基因为TRA基因。5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述内源性抗原受体基因为TRB基因。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，编码所述抗原受体的核酸编码所述抗原受体的α链及β链。7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述导入的工序使用电穿孔来进行。8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，在用CD3/CD28珠粒刺激免疫细胞后在约48小时～约72小时的期间进行所述导入的工序。9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述抗原受体选自T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)及嵌合抗原受体(CAR)。10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶将TRA基因的恒定区内进行切断。11.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶将TRB基因的恒定区内进行切断。12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶为Cas9核酸酶。13.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶为同源二聚体型的核酸酶，所述载体为环状载体。14.根据权利要求1～11及13中任一项所述的方法，其中，所述核酸酶为TALEN。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述核酸酶为铂TALEN。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述核酸酶包含DNA结合域，该DNA结合域自N末端侧起连续地包含多个DNA结合模块，自N末端起第4n
‑
3个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，自N末端起第4n
‑
2个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，自N末端起第4n
‑
1个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n而言均相同，自N末端起第4n个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合就任意的n
而言均相同，自N末端起第4n
‑
3个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合、自N末端起第4n
‑
2个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合、自N末端起第4n
‑
1个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合、以及自N末端起第4n个DNA结合模块中的第x个的氨基酸与第y个的氨基酸的组合互不相同，此处，n为1～10的自然数，x为1～40的自然数，y为1～40的自然数，x和y是不同的自然数。17.根据权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述载体通过所述核酸酶而产生核酸片段，所述核酸片段在从5
’
末端至3
’
末端的方向上依次包括包含第一核苷酸序列的区域、所述所期望的核酸、以及包含第二核苷酸序列的区域，此处，所述细胞所含的核酸在从5
’
末端至3
’
末端的方向上依次包括包含第一核苷酸序列的区域、所述规定部位、以及包含第二核苷酸序列的区域，所述细胞所含的核酸中的第一核苷酸序列与所述载体中的第一核苷酸序列通过微同源介导性接合来连接，所述细胞所含的核酸中的第二核苷酸序列与所述载体中的第二核苷酸序列通过微同源介导性接合来连接，由此插入所述所期望的核酸。18.根据权利要求1～17中任一项所述的方法，其中，所述载体包含多个导入盒，所述导入盒包含编码所述抗原受体的核酸。19.一种载体，其是用于与核酸酶组合而将编码抗原受体的核酸插入细胞所含的核酸中的规定部位的载体，所述载体包含：导入盒，其包含编码该抗原受体的核酸；和微同源序列，其用于产生微同源介导的末端接合(MMEJ)，所述微同源介导的末端接合用于将编码该抗原受体的序列导入该细胞的基因组序列的被该核酸酶切断的部位，所述载体通过所述核酸酶而产生核酸片段，所述核酸片段在从5
’
末端至3
’
末端的方向上依次包括包含第一核苷酸序列的区域、编码所述抗原受体的核酸、以及包含第二核苷酸序列的区域，所述细胞所含的核酸中的第一核苷酸序列与所述载体中的第一核苷酸序列通过微同源介导性接合来连接，所述细胞所含的核酸中的第二核苷酸序列与所述载体中的第二核苷酸序列通过微同源介导性接合来连接，由此插入编码所述抗原受体的序列。20.根据权利要求19所述的载体，其中，所述规定部位存在于所述细胞的内源性抗原受体基因中，编码所述抗原受体的核酸在与所述细胞所含的基于所述核酸酶的靶标部位对应的序列中包含同义置换。21.根据权利要求19所述的载体，其中，编码所述抗原受体的核酸包含EF
‑
1α启动子，所述EF
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1α启动子可操作地连接至所述抗原受体。22.根据权利要求19所述的载体，其中，编码所述抗原受体的核酸包含用于在该抗原受体的上游提高翻译效率的前导序列。23.根据权利要求22所述的载体，其中，所述前导序列为β球蛋白基因的5
’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：一户辰夫，山本卓，佐久间哲史，本庶仁子，川濑孝和，西泽正俊，铃木隆二，马郡健太，佐藤宽之，
申请(专利权)人：组库创世纪株式会社，
类型：发明
国别省市：