过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞及制备方法技术

本发明专利技术公开了转染磁感应蛋白Magr的人脐带间充质干细胞及制备方法，磁感应蛋白基因(Magnetoreceptor，Magr)转染的人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC

【技术实现步骤摘要】
过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞及制备方法


[0001]本专利技术涉及生物技术，特别涉及过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞及制备方法。

技术介绍

[0002]铁是人体所需的营养元素，其参与血红蛋白的合成，维持细胞功能和机体能量补给。功能性铁主要存在于血红蛋白、肌红蛋白、部分酶类等，以铁蛋白和铁血红素形式储存在于肝、脾和骨髓等器官中。当功能铁不足时，人体内储存铁会及时补充，因此，铁平衡的维持至关重要。一旦体内的铁平衡遭到破坏，将会导致机体造成损伤。例如，体内缺少铁则会导致儿童发育不良，以及婴幼儿、孕妇、女性和肿瘤患者等缺铁性贫血。日常生活中，机体往往通过食物或者补铁剂摄取所需的铁元素，但是，体内过量铁元素却适得其反，产生过量的活性氧ROS促使细胞死亡、器官损伤，引起体内氧化应激反应，严重影响人体健康。已有证据证明，铁超载与多种疾病的发病关系密切，如心脑血管疾病、帕金森病、阿尔茨海默病、肝脏疾病、肿瘤等。以神经退行性疾病帕金森病(Parkinson Disease，PD)为例，其是一种常见的神经系统变性疾病，其主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失并伴有纹状体内多巴胺水平的下降。并且通过对PD患者尸体的脑组织检测，发现其中脑黑质侧腹部有明显的铁沉积现象。铁死亡很有可能是引起PD神经退行性变细胞死亡的通路之一，清除过多的铁是治疗PD的有效靶点。
[0003]磁感应受体蛋白(Magnetoreceptor，Magr)，又名ISCA1，是一种线性多聚化的含铁蛋白，存在于多种物种包括鸽子、蝴蝶、甚至人中，其属于铁硫簇蛋白亚家族hesB的成员之一，能够结合铁离子及[2Fe
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2S]簇，参与线粒体铁硫簇生物合成过程中的铁的募集，在细胞能量代谢、电子传递、底物结合与激活、铁/硫存储、酶促反应、基因表达调控等诸多过程中均发挥了关键作用。在酿酒酵母菌中缺失突变IscA1后，铁元素大量积累于线粒体内。并且在蓝藻集胞藻属中发现，IscA羧基端的2个半胱氨酸(Cys110、Cys112)与铁结合密切相关。
[0004]目前，一些干细胞方法正在被研究，作为一种通过再生治疗替代已经凋亡的多巴胺神经元的潜在方法。间充质干细胞(MSCs)具有高度的自我更新能力，免疫原性低，无畸胎瘤风险，伦理问题少，具有向多巴胺能神经元分化和释放神经营养因子的能力等优势，被认为是替代帕金森病等退行性疾病中丢失细胞的理想来源。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术目的是提供一种转染磁感应蛋白的人脐带间充质干细胞。
[0006]本专利技术另一目的是提供所述转染磁感应蛋白的人脐带间充质干细胞的制备方法。
[0007]技术方案：所述的转染磁感应蛋白的人脐带间充质干细胞，磁感应蛋白为转染人种属类型Magr(NCBI ID：32513)。
[0008]进一步地，用NCBI Gene数据库检索MagR(Gene ID：32513)，对人密码子偏好性进行序列优化，优化后的碱基序列为：SEQ ID NO.1。
[0009]进一步地，磁感应蛋白与绿色荧光蛋白eGFP、标签蛋白FLAG，嘌呤霉素Puromycin对干细胞共同标记。
[0010]进一步地，磁感应蛋白连接一段由8个氨基酸残基组成的标签蛋白FLAG
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tag。
[0011]进一步地，利用蛋白免疫共沉淀检测标签蛋白FLAG的表达，验证其转染效率。
[0012]进一步地，磁感应蛋白通过连接绿色蛋白荧光eGFP感染干细胞。
[0013]进一步地，荧光强弱、实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹检测磁感应蛋白目的基因的表达，利用对转录组RNA的表达检测其表达效率。
[0014]所述干细胞为临床上所用的人脐带间充质干细胞。
[0015]所述的转染磁感应蛋白的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
[0016](1)构建目的蛋白的慢病毒，所述磁感应蛋白与绿色荧光蛋白eGFP、标签蛋白FLAG，嘌呤霉素Puromycin对干细胞共同标记；采用GV416为载体，EF1a为启动子表达载体；
[0017](2)将构建的慢病毒与人脐带间充质干细胞混合培养，获得转染磁感应蛋白的人脐带间充质干细胞。
[0018]转染磁感应蛋白的干细胞吸附体内游离铁离子，用于帕金森的治疗。该应用包括：磁感应蛋白在干细胞中过量表达，帕金森铁过载模型的建立及验证，干细胞的脑立体定位注射及ICP检测疾病小鼠病灶区的铁离子含量。铁过载模型包括神经退行性疾病，即帕金森病、阿尔兹海默症以及铁过载造成的骨质疏松等病症。
[0019]磁感应蛋白转染的人脐带间充质干细胞可将患者脑部游离的过量铁转化为氧化铁纳米颗粒，从而进行帕金森疾病治疗。利用转染磁感应蛋白的干细胞用于神经退行性疾病帕金森的细胞疗法，通过聚集病灶部位游离的铁离子，从而减轻病变脑区的铁过载现状，对疾病起到治疗作用。
[0020]有益效果：本专利技术与现有技术相比，具有如下优势：
[0021]1、在间充质干细胞治疗帕金森病的基础上，该专利技术可以先吸附病灶区过量的铁离子，优化干细胞生存、旁分泌等生理环境，增益干细胞治疗效果。
[0022]2、在深部磁刺激治疗帕金森病的基础上，通过吸附游离的铁，矿化为氧化铁纳米颗粒，可以在体外对其区域进行有效的磁场调控，产生分泌神经生长因子等生物效应，从而对病灶区精准、温和、有效治疗。
附图说明
[0023]图1为本专利技术中磁感应蛋白转染人脐带间充质干细胞后的实时定量荧光表达；
[0024]图2为本专利技术中利用干细胞治疗帕金森病小鼠后行为学检测，即转棒实验；
[0025]图3为利用干细胞治疗帕金森病小鼠后，电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP
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MS)检测病灶部位铁离子含量；
[0026]图4为载体图谱；
[0027]图5为酶切结果；
[0028]图6为电泳图，PCR产物大小：443；
[0029]图7为电泳图，阳性转化子PCR产物大小：563阴性转化子PCR产物大小：167。
具体实施方式
[0030]本实施例利用磁感应蛋白转染的脐带间充质干细胞的制备方法，包括过表达慢病毒载体构建、利用过表达慢病毒对人脐带间充质干细胞进行转染、细胞中目的基因的过表达验证、目的细胞导入帕金森病小鼠纹状体内以及验证目的细胞吸附铁离子情况及对疾病的治疗作用。
[0031]实施例1：过表达MagR慢病毒载体的构建(载体图谱见图4)
[0032][0033][0034]酶切结果见图5。
[0035]电泳图说明：
[0036]1#：10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)
[0037]2#：载体酶切产物
[0038]3#：未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞，其特征在于：磁感应蛋白为转染人种属类型Magr(NCBI ID：32513)。2.根据权利要求1所述的过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞，其特征在于：用NCBI Gene数据库检索Magr(Gene ID：32513)，对人密码子偏好性进行序列优化，优化后的碱基序列为：SEQ ID NO.1。3.根据权利要求1所述的过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞，其特征在于：磁感应蛋白与绿色荧光蛋白eGFP、标签蛋白FLAG，嘌呤霉素Puromycin对干细胞共同标记。4.根据权利要求1所述的过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞，其特征在于：磁感应蛋白连接一段由8个氨基酸残基组成的标签蛋白FLAG
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tag。5.根据权利要求4所述的过表达Magr调节体内铁稳态的干细胞，其特征在于：利用蛋白免疫共沉淀检测标签蛋白FLAG的表达，验证其转染效率。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：孙剑飞，叶青，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：