孔雀成纤维永生化细胞系的制备方法及其在病毒扩增中的应用技术

一种孔雀成纤维永生化细胞系的制备方法及其在病毒扩增中的应用，通过将编码hTERT基因的真核表达质粒pCI

【技术实现步骤摘要】
孔雀成纤维永生化细胞系的制备方法及其在病毒扩增中的应用


[0001]本专利技术涉及的是一种生物医药领域的技术，具体是一种孔雀成纤维永生化细胞系的制备方法及其在病毒扩增中的应用。

技术介绍

[0002]新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科，副粘病毒科亚科。被世界卫生组织定为A类传染病的负链RNA病毒能够感染多种畜禽而且死亡率很高。尽管感染NDV后，孔雀的死亡率低，但临床研究发现，高致病性新城疫病毒能够感染蓝孔雀。
[0003]禽流感病毒(AIV)属甲型流感病毒，正黏病毒科RNA病毒。被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现为轻度的呼吸道症状。但H9禽流感病毒可以感染人，一旦蓝孔雀感染H9亚型禽流感会对人类健康存在严重的威胁。
[0004]孔雀是公认的抗病能力强的禽类，禽流感(AIV)或新城疫病毒(NDV)等禽类强致病性病毒也能感染孔雀，然而，AIV和NDV对孔雀的致病性显著低于其它禽类。尽管AIV和NDV对孔雀致病性偏低，但孔雀感染AIV和NDV后，却可作为中间宿主将病毒传播给人类，引起人类疾病。目前主要应用的禽类商品化细胞系为鸡成纤维细胞系DF
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1，然而，DF
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1细胞系感染新城疫、禽流感等病毒后极易死亡，导致病毒产量极低，限制了其在疫苗生产中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术制备得到的成纤维永生化细胞系经病毒感染细胞后上清液病毒含量低、病毒感染细胞后关键的细胞因子表达很低，无法满足生成疫苗要求的不足，提出一种孔雀成纤维永生化细胞系的制备方法及其在病毒扩增中的应用，采用基因重组技术，将端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转染孔雀原代成纤维细胞，首次建立制备永生化的孔雀细胞系的方法。制备出永生化的孔雀成纤维细胞，生长旺盛、速度快。禽流感和新城疫等禽类病毒可以在该细胞中高效复制，且复制能力显著高于目前在用的MDCK细胞，使用方便，可以用来生产禽用病毒疫苗。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]本专利技术涉及一种基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，通过将编码hTERT基因的真核表达质粒pCI
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neo
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hTERT转入原代培养的孔雀成纤维细胞，经筛选后连续培养至50代，得到永生化的细胞系PEF
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1，用于感染新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)及水泡性口炎病毒 (VSV)，实现高效增殖。
[0008]所述的原代培养的孔雀成纤维细胞，采用但不限于分离孔雀胚胎成纤维组织，剪碎至 1mm3大小后，经胰蛋白酶消化接种至细胞培养皿得到。
[0009]所述的真核表达质粒pCI
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neo
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hTERT具有G418抗性。
[0010]所述的筛选，优选在孔雀成纤维细胞转染24h后用1000ng/mL G418筛选阳性克隆，连续培养具有G418抗性的阳性克隆。
[0011]所述的连续培养，优选将筛选得到的阳性克隆连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系PEF
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1。
[0012]所述的永生化的细胞系PEF
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1经梯度降温后，可置于液氮中长期保存，复苏后可继续正常培养。
[0013]所述的转入，具体为：采用脂质体转染方法，将编码hTERT和Neo基因的真核表达质粒pCI
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neo
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hTERT与脂质体预混后转入原代培养的孔雀成纤维细胞。
[0014]所述Neo为Marker基因。
[0015]所述的病毒水泡性口炎病毒为VSV
‑
GFP包含绿色荧光蛋白。
[0016]所述的新城疫病毒为LaSota株包含绿色荧光蛋白。
[0017]所述的禽流感病毒为A/Chicken/Shanghai/010/2008(H9N2)
‑
SH010株。
[0018]本专利技术涉及一种基于上述应用得到的孔雀成纤维细胞系生产病毒疫苗，通过在制备得到的永生化的孔雀成纤维细胞系与MDCK细胞系中接种禽流感病毒(AIV)，新城疫病毒(NDV
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GFP)以及水泡性口炎病毒(VSV
‑
GFP)，培养增殖并收获病毒后，通过TCID
50
检测病毒滴度。
[0019]所述的检测病毒滴度是指：将的孔雀成纤维细胞系接种于细胞瓶，待长满单层后，传代至96孔板，继续培养；将病毒上清10倍梯度稀释，从10
‑1‑
10
‑
10
；将稀释好的病毒接种至96孔板长成致密单层后的孔雀成纤维细胞系中，每一稀释度接种8个孔，同时设阴性对照，至于37℃CO2培养箱中继续培养；接种4
‑
5天，记录每个稀释度出现细胞病变(CEP)的孔数，计算病毒滴度。技术效果
[0020]本专利技术通过分离培养了孔雀原代成纤维细胞，并利用真核表达质粒pCI
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neo
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hTERT探索并构建了孔雀成纤维细胞系，该细胞系易感染病毒，且病毒产量高，能够作为生产禽源病毒疫苗的工具。
附图说明
[0021]图1为G418药筛之后传连续传代培养的孔雀成纤维细胞示意图；
[0022]图2为经冻存复苏后的孔雀成纤维细胞系示意图；
[0023]图3为Western Blot检测细胞hTERT基因的蛋白表达示意图；
[0024]图4为永生化的孔雀成纤维细胞系与MDCK细胞系接种新城疫病毒(NDV
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GDP)，禽流感病毒(AIV)，和水泡性口炎病毒(VSV
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GFP)后，细胞病变以及荧光图示意图；
[0025]图5为永生化的孔雀成纤维细胞系与MDCK细胞系感染病毒后，病毒滴度检测示意图。
具体实施方式
[0026]本实施例涉及一种孔雀成纤维细胞系的构建方法，所涉及的pCI
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neo
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hTERT真核表达系统购自Addgene公司；所采用的蓝孔雀胚购自芜湖如意生态农业有限公司。
[0027]本实施例具体包括以下步骤：
[0028]步骤1、孔雀成纤维细胞的分离与培养：将0日龄的孔雀胚放置37℃，50％恒温恒湿孵化箱，孵化10天后无菌取孔雀胚，去掉胚胎头，四肢，内脏和骨骼后用加1％双抗的PBS 洗三次，将剩余组织剪成约1mm3大小的组织块，转移至50mL离心管中，加适量胰蛋白酶 (含胰酶0.05％，含EDTA 0.02％)，37℃水浴摇床消化15min，直到无明显组织块后，加等体积DMEM+10％FBS的培养基终止消化，用70μm和100μm滤筛过滤。将滤液1000g离心5 分钟后用DMEM+10％FBS的培养基重悬后接种于10cm细胞培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征在于，通过将编码hTERT基因的真核表达质粒pCI
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hTERT转入原代培养的孔雀成纤维细胞，经筛选后连续培养，得到永生化的细胞系PEF
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1，用于感染新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)及水泡性口炎病毒(VSV)，实现高效增殖。2.根据权利要求1所述的基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征是，所述的原代培养的孔雀成纤维细胞，通过分离孔雀胚胎成纤维组织，剪碎至1mm3大小后，经胰蛋白酶消化接种至细胞培养皿得到。3.根据权利要求1所述的基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征是，所述的真核表达质粒pCI
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neo
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hTERT具有G418抗性。4.根据权利要求1或3所述的基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征是，所述的筛选，在孔雀成纤维细胞转染24h后用1000ng/mL G418筛选阳性克隆，连续培养具有G418抗性的阳性克隆。5.根据权利要求1所述的基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征是，所述的连续培养，将筛选得到的阳性克隆连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系PEF
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1。6.根据权利要求1所述的基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征是，所述的永生化的细胞系PEF
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1经梯度降温后，可置于液氮中长期保存，复苏后可继续正常培养。7.根据权利要求1所述的基于孔雀成纤维永生化细胞系的应用，其特征是，所述的转入，具体为：采用脂质体转染方法，将编码hTE...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，程玉强，王杰，严亚贤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：