靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的高亲和力单克隆抗体和使用方法技术

本公开描述了特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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1的高亲和力单克隆抗体和使用方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2019年1月22日提交的美国临时申请No.62/795,415的权益，在此通过引用以其全文并入本文。


[0003]本公开涉及以高亲和力特异性结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖
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1(glypican
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1，GPC1)的单克隆抗体以及该单克隆抗体的用途，例如用于诊断和治疗表达GPC1的肿瘤。
[0004]政府支持的承认
[0005]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的项目编号Z01 BC010891的政府支持下完成的。政府对本专利技术享有一定的权利。

技术介绍

[0006]磷脂酰肌醇蛋白聚糖是细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，具有通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)键锚定到细胞质膜的膜相关蛋白核心。翻译后，HSPG通过两个或更多个线性多糖硫酸乙酰肝素链的共价连接进行修饰(Davies et al.,Clin Cancer Res 10:5178
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5186,2004)。已在哺乳动物中鉴定出六种磷脂酰肌醇蛋白聚糖，称为GPC1至GPC6。GPC家族的几个成员与癌症的发展或进展有关。GPC1在多种不同的癌症中过度表达，包括胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、结直肠癌和卵巢癌。
[0007]胰腺癌是美国第四大癌症死亡原因。这种致命疾病的总体5年生存率不到5％。虽然嵌合抗原受体(CAR)T细胞的免疫疗法在某些血液恶性肿瘤中显示出前景，但它们对实体肿瘤(包括胰腺癌)的疗效仍然难以捉摸。因此，仍然迫切需要为胰腺癌和其他类型的癌症患者鉴定和验证CAR T细胞治疗的新靶点。

技术实现思路

[0008]本公开描述了小鼠单克隆抗体和骆驼单域单克隆抗体，两者均靶向GPC1。该GPC1特异性抗体，称为HM2和D4，以高亲和力特异性结合GPC1。由所公开的抗体组成的嵌合抗原受体(CAR)T细胞能够在体外和体内有效地杀死GPC1阳性肿瘤细胞。
[0009]本文提供结合例如特异性结合GPC1的单克隆抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体包括HM2或D4的互补决定区(CDR)序列。本文还提供了包括所公开的单克隆抗体的偶联物。在一些实例中，提供了包括本文公开的单克隆抗体的CAR(和表达CAR的T细胞和自然杀伤细胞)、免疫偶联物(例如免疫毒素)、多特异性抗体(例如双特异性T细胞接合物)、抗体药物偶联物(ADC)、抗体
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纳米颗粒偶联物、抗体
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放射性同位素偶联物(例如用于癌症诊断和免疫PET成像)和的融合蛋白。
[0010]本文还提供了经修饰以使其能够与通用CAR系统一起使用的GPC1特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，该GPC1特异性单克隆抗体与特异性结合对的一个组分融合。在一些
实例中，该单克隆抗体与亮氨酸拉链、生物素或分选酶识别基序融合。
[0011]本公开还提供了包括GPC1特异性单克隆抗体和药学上可接受的载体的组合物。
[0012]本文还提供了编码本文公开的GPC1特异性单克隆抗体、CAR、免疫偶联物(例如免疫毒素)、多特异性抗体和融合蛋白的核酸分子和载体。
[0013]进一步提供了编码GPC1特异性CAR和截短的人表皮生长因子受体(huEGFRt)的核酸构建体。所编码的CAR包括与细胞外铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域融合的GPC1特异性单克隆抗体。该huEGFRt包括两个EGFR胞外结构域(结构域III和结构域IV)和EGFR跨膜域，但缺少两个膜远端胞外结构域和所有胞内结构域。在一些实施方案中，该核酸分子以5'至3'方向包括编码第一信号序列的核酸；编码GPC1特异性抗体的核酸；编码胞外铰链区的核酸；编码跨膜结构域的核酸；编码胞内共刺激结构域的核酸；编码胞内信号传导结构域的核酸；编码自切割2A肽的核酸；编码第二信号序列的核酸；以及编码huEGFRt的核酸。还提供了包括本文公开的核酸分子的载体，例如病毒载体。还公开了共表达所公开的CAR和huEGFRt的分离的细胞，例如T淋巴细胞。
[0014]还提供了治疗受试者中GPC1阳性癌症的方法，以及抑制受试者中GPC1阳性癌症的肿瘤生长或转移的方法。在一些实施方案中，这些方法包括以本文公开的单克隆抗体向该受试者给药，或以包括本文公开的单克隆抗体的CAR(或CAR T细胞或CAR NK细胞)、免疫偶联物(例如免疫毒素)、ADC、多特异性抗体、抗体
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纳米颗粒偶联物或融合蛋白向该受试者给药。
[0015]本文进一步提供了检测样品中GPC1表达的方法。在一些实施方案中，该方法包括将样品与本文公开的单克隆抗体接触，并检测该抗体与样品的结合。
[0016]还提供了将受试者诊断为患有GPC1阳性癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括使从受试者获得的样品与本文公开的单克隆抗体接触，并检测该抗体与样品的结合。在一些实例中，该样品是含有外泌体的血清样品。
[0017]从以下参照附图进行的详细描述中，本公开的前述和其他目的和特征将变得更加明显。
附图说明
[0018]图1A
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1B:通过噬菌体展示分离GPC1特异性骆驼单域单克隆抗体。(图1A)来自每轮淘选的输出噬菌体的多克隆噬菌体ELISA。HuGPC1：人GPC1。(图1B)GPC1结合物D4与小鼠GPC1(MsGPC1)和人磷脂酰肌醇蛋白聚糖的交叉反应性的单克隆噬菌体ELISA分析。
[0019]图2:使用D4抗体对细胞表面GPC1表达进行流式细胞术分析。评估了D4与过表达GPC1的2B9 KLM胰腺癌细胞、过表达GPC1的H8表皮样癌细胞和GPC1阴性A431细胞的结合。白色峰代表用同种型对照抗体染色的细胞表面，阴影峰代表用GPC1特异性D4抗体染色的细胞表面。D4以5μg/ml的浓度使用。
[0020]图3:对D4抗体和人GPC1之间相互作用的动力学分析。D4对人GPC1的亲和力计算为K
D
＝1.3nM。
[0021]图4:HM2抗GPC1单克隆抗体与GPC1和其他磷脂酰肌醇蛋白聚糖蛋白的结合通过ELISA进行评估。HM2特异性结合GPC1。
[0022]图5:使用HM2抗体对细胞表面GPC1表达进行流式细胞术分析。评估了HM2与过表达
GPC1的2B9 KLM胰腺癌细胞、过表达GPC1的H8表皮样癌细胞、GPC1阳性T3M4胰腺癌细胞和GPC1阴性A431细胞的结合。白色峰代表用同种型对照抗体染色的细胞表面，阴影峰代表用GPC1特异性HM2抗体染色的细胞表面。HM2以10μg/ml的浓度使用。
[0023]图6:HM2抗体和人GPC1之间相互作用的动力学分析。HM2对人GPC1的亲和力计算为K
D
＝1.2nM。
[0024]图7:GPC1在人胰腺肿瘤中的表达。通过免疫组织化学测定的GPC1在正常胰腺(i本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO:6有至少90％同一性并且包括SEQ ID NO:6的CDR1、CDR2和CDR3序列。14.根据权利要求12或权利要求13所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的氨基酸序列包括或由SEQ ID NO:6组成。15.根据权利要求12
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14中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为骆驼抗体。16.根据权利要求12
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14中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为人源化抗体。17.根据权利要求12
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14中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体为嵌合抗体。18.一种嵌合抗原受体(CAR)，包括权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体。19.根据权利要求18所述的CAR，还包括铰链区、跨膜结构域、共刺激信号传导部分、信号传导结构域、或其任何组合。20.根据权利要求19所述的CAR，其中所述铰链区包括CD8α铰链区。21.根据权利要求19或权利要求20所述的CAR，其中所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。22.根据权利要求19
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21中任一项所述的CAR，其中所述共刺激信号传导部分包括4
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1BB信号传导部分。23.根据权利要求19
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22中任一项所述的CAR，其中所述信号传导结构域包括CD3ξ信号传导结构域。24.一种分离的细胞，表达权利要求18
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23中任一项所述的CAR。25.根据权利要求24所述的分离的细胞，其为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或自然杀伤(NK)细胞。26.一种免疫偶联物，包括权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体和效应分子。27.根据权利要求26所述的免疫偶联物，其中所述效应分子为毒素。28.根据权利要求27所述的免疫偶联物，其中所述毒素为假单胞菌外毒素或其变体。29.根据权利要求28所述的免疫偶联物，其中所述假单胞菌外毒素变体为PE
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LR。30.根据权利要求26
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29中任一项所述的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物的氨基酸序列包括SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21。31.根据权利要求26所述的免疫偶联物，其中所述效应分子为光子吸收剂或可检测标签。32.根据权利要求31所述的免疫偶联物，其中所述可检测标签包括荧光团、酶或放射性同位素。33.一种抗体药物偶联物(ADC)，包括与权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体偶联的药物。34.根据权利要求33所述的ADC，其中所述药物为小分子。35.根据权利要求33或权利要求34所述的ADC，其中所述药物为抗微管剂、抗有丝分裂剂和/或细胞毒性剂。36.一种多特异性抗体，包括权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体和至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段。
37.根据权利要求36所述的多特异性抗体，其为双特异性抗体。38.根据权利要求36所述的多特异性抗体，其为三特异性抗体。39.根据权利要求36
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38中任一项所述的多特异性抗体，其中所述至少一种另外的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合T细胞受体或自然杀伤(NK)活化受体的组分。40.一种抗体
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纳米颗粒偶联物，包括与权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体偶联的纳米颗粒。41.根据权利要求40所述的抗体
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纳米颗粒偶联物，其中所述纳米颗粒包括聚合物纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊、脂质体、树枝状聚合物、聚合物胶束、或类脂质体。42.根据权利要求40或权利要求41所述的抗体
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纳米颗粒偶联物，其中所述纳米颗粒包括细胞毒性剂。43.一种融合蛋白，包括权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体和异源蛋白或肽。44.根据权利要求43所述的融合蛋白，其中所述异源蛋白为Fc蛋白或亮氨酸拉链。45.一种分离的核酸分子，编码权利要求1
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17中任一项所述的单克隆抗体、权利要求18
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23中任一项所述的CAR、权利要求26
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29中任一项所述的免疫偶联物、权利要求36
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39中任一项所述的多特异性抗体或权利要求43或权利要求44所述的融合蛋白。46.根据权利要求45所述的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或其简并变体；SEQ ID NO:3的核苷酸序列，或其简并变体；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列，或它们的简并变体；或者SEQ ID NO:5的核苷酸序列，或其简并变体。47.根据权利要求45所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码免疫偶联物并包括：SEQ ID NO:14，或其简并变体；SEQ ID NO:16，或其简并变体；SEQ ID NO:18，或其简并变体；或者SEQ ID NO:20，或其简并变体。48.根据权利要求45
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47中任一项所述的分离的核酸分子，被可操作地连接至启动子。49.一种载体，包括权利要求45
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48中任一项所述的核酸分子。50.一种编码嵌...

【专利技术属性】
技术研发人员：何苗壮，潘佳佳，李楠，
申请(专利权)人：美国政府由卫生和人类服务部的部长所代表，
类型：发明
国别省市：