成体多能干细胞的制备、扩增及应用制造技术

存在于哺乳动物的外周血中的某些相对较小的细胞能够被活化以形成多能干细胞群。这些小细胞通常直径小于5μm，并且是CD45阳性的，在本文中称为CD45

Preparation, amplification and application of adult pluripotent stem cells

Some relatively small cells in mammalian peripheral blood can be activated to form a pluripotent stem cell population. These small cells are usually less than 5 \u03bc m in diameter and are CD45 positive. In this paper, they are called CD45

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】成体多能干细胞的制备、扩增及应用相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年4月4日提交的美国临时申请序列号62/481,554的权益，其全部内容通过引用并入本文。背景干细胞的鉴定和表征是再生医学的主要焦点。干细胞能够自我更新，这种特性确保其存活和产生维持组织稳态所必需的有丝分裂后的细胞的能力。除了自我更新的能力之外，干细胞还具有能够分化成维持特定组织、器官系统甚至整个生物体内的稳态所需的细胞类型中的一些或全部的能力。干细胞被分离时所处的发育阶段通常决定了其能够分化成哪种类型的细胞。例如，从胚泡的内细胞团分离的胚胎干（ES）细胞是多能的并且能够分化成三个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）中的任何一个。然而，在各种成体组织（例如骨髓、脂肪组织、血液等）中发现的成体或躯体干细胞通常在分化方面受到更多限制，因此被认为是多能的、寡能的或单能的。成体干细胞包括几种类型，如造血干细胞（HSC）、间充质干细胞（MSC）、内皮干细胞（ESC）、乳腺干细胞（MaSC）、肠干细胞（ISC）、神经干细胞（NSC）、成体嗅觉干细胞（OSC）、神经嵴干细胞（NCSC）和睾丸干细胞（TSC）。诱导的多能干细胞（也称为iPS细胞或iPSC）是一种多能干细胞，其能够通过引入特定的多能性相关的基因或“重编程因子”组而直接从体细胞产生。其他类型的干细胞也已经被报道，其存在仍然是有争议的。30多年来，骨髓已经被用于治疗患有例如白血病和淋巴瘤等疾病的癌症患者。这是广泛实施的干细胞疗法的唯一形式。关于胚胎干细胞，人类胚胎干细胞（hESC）研究在伦理和政治上存在争议，因为它涉及人类胚胎的破坏或至少涉及其操作。hESC的致瘤性也是使用hESC的细胞疗法的临床障碍。此外，迄今为止尚无法建立患者匹配的胚胎干细胞系。关于iPSC，体细胞的重编程产生iPSC避免了hESC研究特有的伦理问题。然而，iPSC的产生需要遗传改变/修饰，其也以某种方式与癌症相关。产生iPSC的非遗传方法（例如，使用重组蛋白）通常具有低效率。因此，iPSC技术尚未发展到治疗性移植被认为是安全的阶段。关于成体干细胞，它们在研究和治疗中的应用不被认为是有争议的。然而，与多能干细胞不同，成体干细胞局限于某些类型或“谱系”。因此，成体干细胞疗法需要所需特定谱系的干细胞来源，并且收获和/或培养它们达到所需数量是一个挑战。因此，从成体组织中鉴定多能干细胞而不需要遗传操作，并建立体外培养它们的方案，将为实际的基于细胞的组织修复和再生治疗铺平道路。从成体组织分离的这种多能干细胞还将为慢性和衰老相关疾病中未满足的医学需求提供新的治疗方法。细胞培养系统将是干细胞研究和开发的有力资产。该领域最大的挑战之一是建立一个使得干细胞在体外能够快速扩增以及有效和精确地分化的模型。这种模型必须具有提供大量在某些培养条件下能够经历靶向和可控的分化的同质细胞的能力。目前，没有普遍接受的用于满足治疗要求的多能干细胞的可持续细胞培养模型。此外，目前的多能干细胞在诸如分离、体外扩增和/或分化诱导的过程中具有各种问题和缺陷，这将阻碍目前的多能干细胞在临床应用和治疗用途中的应用。因此，需要不进行遗传操作而从成体组织中鉴定多能干细胞，其中多能干细胞能够在体外快速扩增、具有高分化效率且是非致瘤性的。还需要建立用于在体外培养多能干细胞用于基于细胞的疗法的方案。概述从成体组织中鉴定可扩增的多能干细胞并建立体外培养它们的方案，将为实际的基于细胞的组织修复和再生治疗铺平道路。本公开提供了一种组合物，其包含至少1000个细胞，并且至少50％的细胞是表达CD45且直径小于5μm的CD45+细胞。在一些方面，CD45+细胞进一步被表征为CD34阳性和ABCG2阴性。在一些方面，少于20％的细胞是红细胞。在一些方面，CD45+细胞进一步被表征为Lin阴性。在一些方面，CD45+细胞进一步表达一种或多种选自以下的标记物：CD44、CD150、Sca1、c-kit、Thy1.1（CD90.1）、Oct4、SSEA1、Nanog、Vasa、CD133和CD105。在一些方面，CD45+细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD41、Lin、E-钙粘蛋白和CD184（CXCR4）。在一些方面，CD45+细胞能够被包含一种或多种因子的培养基活化，并且被活化的细胞表达ABCG2。还提供了制备本文公开的组合物的方法，包含（1）从血液样品中除去至少一部分的红细胞；（2）从样品中除去至少一部分的血小板；（3）以400xg-3000xg离心样品；以及（4）获得包含本文公开的组合物的小丸（pellet）。在一些方面，在步骤（3）中，以至少3000xg的速度离心样品。还提供了培养细胞的方法，包含在培养基中培养多种哺乳动物细胞，所述培养基与选自原代肝细胞、人肝母细胞瘤（HepG2）细胞、肝细胞细胞系和小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞系中的至少一种接触或已经用其进行了调节。在一些方面，肝细胞细胞系包含AML12、HepaRG或其组合。在一些方面，哺乳动物细胞（a）直径小于5μm，且（b）表达CD45。在一些方面，其中细胞进一步被表征为CD34阳性和ABCG2阴性。在一些方面，哺乳动物细胞包括一种或多种类型的干细胞。本公开还提供了分离的哺乳动物细胞，其表达CD34和ABCG2并且不表达CD45。在一些方面，哺乳动物细胞进一步被表征为Oct4、Nanog和/或角蛋白上皮（keratinepithelium）阳性，而Lin阴性。在一些方面，哺乳动物细胞进一步表达一种或多种选自以下的标记物：D117、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、Sca1、CD31、CD184、巢蛋白和骨钙素。在一些方面，哺乳动物细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD3、CD4、CD8a、CD11b、CD13、CD140a、E-钙粘蛋白和Lin。还提供了如本文所公开的细胞的群体。还提供了一种干细胞，其衍生自的细胞（a）具有小于5μm的直径；（b）表达CD45；且（c）不表达ABCG2，其中干细胞表达ABCG2，并且进一步被表征为（a）CD34+/CD45+；（b）CD34+/CD45-；（c）CD34-/CD45+；或（d）CD34-/CD45-。本公开的实施方案还提供了从本文公开的干细胞分化的细胞。还提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的如本文所公开的干细胞。在一些实施方案中，还提供了一种组合物，其包含在药学上可接受的载体或赋形剂中的如本文所公开的分化细胞。还提供了治疗有此需要的对象中的疾病或病症的方法，包含向对象施用有效量的如本文所公开的组合物。附图说明图1显示了从血液中分离的休眠的微小细胞（dormanttinycell）的电子显微镜图像。图2是显示在体外休眠的微小细胞和由其衍生的活化干细胞的细胞核染色长达7天的图解、以及在第7天细胞中GFP表达的图解。图3A是显示休眠的微小细胞和由其衍生的活化干细胞中ABCG2表达的图解。图3B是显示表达CD34和CD45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含至少1000个细胞，其中至少50％的所述细胞是表达CD45且直径小于5 µm的CD45

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170404 US 62/481,5541.一种组合物，其包含至少1000个细胞，其中至少50％的所述细胞是表达CD45且直径小于5µm的CD45+细胞。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CD45+细胞进一步被表征为CD34阳性且ABCG2阴性。


3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中至少75％的所述细胞是CD45+细胞。


4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中至少95％的所述细胞是CD45+细胞。


5.根据权利要求1-4的任一项所述的组合物，其包含至少10,000个细胞。


6.根据权利要求1-5的任一项所述的组合物，其中少于20％的所述细胞是红细胞。


7.根据权利要求1-6的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞的直径小于3μm。


8.根据权利要求1-6的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞的直径是约2μm至约3μm。


9.根据权利要求1-8的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞进一步被表征为Lin阴性。


10.根据权利要求1-9的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞包含小RNA和核糖体RNA，其中小RNA与核糖体RNA的比例为至少约20：1、或至少约15：1、或至少约10：1、或至少约5：1。


11.根据权利要求1-10的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞的核质比（v/v）是至少约9：1、或至少约8：1、或至少约7：1、或至少约6：1、或至少约5：1。


12.根据权利要求1-11的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞进一步表达一种或多种选自以下的标记物：CD44、CD150、Sca1、c-kit、Thy1.1(CD90.1)、Oct4、SSEA1、Nanog、Vasa、CD133和CD105。


13.根据权利要求1-12的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞不表达一种或多种选自以下的标记物：CD41、Lin、E-钙粘蛋白和CD184。


14.根据权利要求1-13的任一项所述的组合物，其中所述CD45+细胞能够被包含一种或多种因子的培养基活化，其中被活化的细胞表达ABCG2。


15.一种培养细胞的方法，其包含：在培养基中培养多种哺乳动物细胞，该培养基与选自原代肝细胞、人肝母细胞瘤（HepG2）细胞、肝细胞细胞系和小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞系中的至少一种接触或已经用其进行了调节。


16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞（a）直径小于5μm，且（b）表达CD45。


17.根据要求要求15所述的方法，其中所述细胞进一步被表征为CD34阳性和ABCG2阴性。


18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞在培养之后表达ABCG2。


19.根据权利要求18所述的方法，其中所述培养至少持续1小时。


20.根据权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包含至少一种选自以下的细胞：胚胎干（ES）细胞、造血干细胞（HSC）、间充质干细胞（MSC）、内皮干细胞（ESC）、乳腺干细胞（MaSC）、肠干细胞（ISC）、神经干细胞（NSC）、成体嗅觉干细胞（OSC）、神经嵴干细胞（NCSC）、睾丸干细胞（TSC）和诱导的多能干细胞（iPSC）。


21.根据权利要求15-20的任一项所述的方法，其中所述肝细胞细胞系包含AML12、HepaRG、或其组合。


22.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。


23.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、HepG2细胞和肝细胞细胞系接触或已经用其进行了调节。


24.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、HepG2细胞和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。


25.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原代肝细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。


26.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与HepG2细胞、肝细胞细胞系和MEF细胞系接触或已经用其进行了调节。


27.根据权利要求15-21的任一项所述的方法，其中所述培养基至少与原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李劭伟，胡敏，赫尔曼·彼得·洛伦兹，
申请(专利权)人：小利兰·斯坦福大学托管委员会，
类型：发明
国别省市：美国;US