RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒，属于分子生物学检测技术领域。本发明专利技术提供的RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。本发明专利技术提供的试剂盒检测快速、灵敏、操作简便，对未来检测溶血性链球菌传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学检测
，具体涉及RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒。
技术介绍
溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。α-溶血性链球菌：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。β-溶血性链球菌：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。溶血性链球菌的致病性与其产生的毒素及其侵袭性酶有关。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。传统通用检测方法为：样品处理:取25g固体(或25mL液体)检样加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。分离培养：吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线于血平板(如检溶血性链球菌样污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤)，36℃培养24h，接种血平板，36℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验。链激酶试验：吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18-24h36℃肉浸液肉汤培养物0.5mL及0.25％氯化钙0.25mL，混匀，置于36℃水浴10min，血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。杆菌肽敏感试验：取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片置于上述平板上，36℃培养18-24h，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。虽然传统溶血性链球菌检测方法是可靠的，但却很费力、耗时，需要4～7天才能完成。由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。因此，在需要及时、快速评价食品中微生物的安全性时，通常不被采用。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感且适用的溶血性链球菌检测方法，其中许多可以在48h内检出溶血性链球菌，这些方法通称为快速检测。分子生物学方法具有灵敏度高、特异性强等优点，主要的技术有聚合酶链式反应(简称PCR)和环介导等温扩增技术。聚合酶链式反应(简称PCR)创立于1985年，目前已成为病原微生物检测的常规技术，具有特异性强、灵敏度高等特点，但该方法对仪器要求及人员的专业素养要求高，且需要一定的硬件支持，检测时间1.5～2小时，对提取的DNA纯度要求高。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是由日本学者NotomiT等人针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)作用下，60～65℃恒温扩增，15～60分钟其扩增效率可达到109～1010个数量级。但此方法设计复杂，假阳性出现高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组及试剂盒。本专利技术提供的试剂盒检测快速、灵敏、操作简便，对未来检测溶血性链球菌传播具有非常重要的意义，具有较大的应用前景。本专利技术提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述探针为在SEQIDNo.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。优选的是，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；优选的是，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。本专利技术还提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。优选的是，所述的探针使用浓度为0.02～0.05mM。优选的是，所述上游引物和下游引物的使用浓度独立地为0.05～0.1mM。优选的是，还包括RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。优选的是，所述反应缓冲液包括：使用浓度为450mM的Tris-HClBuffer、260mM的MgAc和20％W/V的PEG10000。优选的是，还包括：阴性质控品、阳性质控品和临界阳性质控品；所述阴性质控品为不含有溶血性链球菌的基因组片段的试剂；所述阳性质控品含为溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×104IU/mL；所述临界阳性质控品为含溶血性链球菌的基因组DNA片段，使用浓度至少为1.0×103IU/mL。本专利技术提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组。本专利技术提供的引物探针组能够实现溶血性链球菌的高特异性检测，灵敏度高且检测快速、重复性好。试验结果表明，本专利技术提供的引物探针组只需在39℃下反应5～20min即可分析结果，检测快速、灵敏，操作简单，通过实例验证检测准确率100％，假阳性率为0；对未来检测溶血性链球菌传播具有非常重要的意义，具有很大的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的荧光检测结果；图2为本专利技术实施例2提供的荧光检测结果；图3为本专利技术实施例3提供的荧光检测结果。具体实施方式本专利技术提供了RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述探针为在SEQIDNo.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。在本专利技术中，所述上游引物的核苷酸序列SEQIDNO.1为5’-CAACAGTAGCAGCAGATGAGCTAACCACAACG-3’；所述下游引物的核苷酸序列SEQIDNO.2为5’-CAACCTTGCCTTGTCCTTTGTATCCCTTGTC-3’；本专利技术对所述上游引物和下游引物的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行人工合成即可，如生工生物工程(上海)股份有限公司。本专利技术所述探针为在SEQIDNo.3所示序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。在本专利技术中，所述探针在修饰前，即SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。

【技术特征摘要】
1.RAA荧光法检测溶血性链球菌的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述探针为在SEQIDNo.3所示核苷酸序列的第40位碱基修饰荧光报告基团、第42位碱基修饰四氢呋喃残基和第43位碱基修饰淬灭基团的物质。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5。3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。4.RAA荧光法检测溶血性链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任意一项所述的引物探针组。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏莹，张小平，杨永耀，薛仕杰，吴忠华，郑伟，郭利川，汤赛君，王智宏，应清界，李可，谢国骏，林晓霞，孙丹妮，
申请(专利权)人：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局，江苏奇天基因生物科技有限公司，浙江国际旅行卫生保健中心浙江出入境检验检疫局口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：浙江,33