一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒，属于微生物检测技术领域。本发明专利技术提供的用于检测牛棒状杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物的序列如SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术提供的特异性引物，特异性好，灵敏度高，能够实现牛棒状杆菌的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒
本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒。
技术介绍
牛棒状杆菌(Corynebacteriumbovis，C.bovis)是一种革兰氏阳性杆菌，条件性致病，世界范围内广泛分布，可感染多种动物，可导致裸小鼠表皮角化过度，俗称“鳞皮病”，也是引起奶牛乳房炎的常见病原菌之一。无毛和免疫缺陷鼠一旦感染，几乎终身携带。具有免疫活性的大鼠、小鼠一般不会长期携带。感染小鼠表现鳞屑状皮炎，SCID小鼠则出现脱毛、形成秃块等症状。通常呈一过性感染，感染后7～10天出现“鳞屑”，14～20天内自行消失，但感染至少要持续30天左右。组织学检查可出现棘皮症、角化过度，真皮层可观察到单核细胞浸润。动物感染通常伴随体重减轻、结膜充血、摄水量增加、异种移植物生长缓慢等现象。感染牛棒状杆菌引起角化过度和体重减轻的小鼠，被认为不适用于科学实验。牛棒状杆菌感染可影响肿瘤生长、干扰异种移植、改变自然杀伤(NK)细胞活性等。C.bovis已被全球众多实验动物机构列为实验大鼠、小鼠，尤其是裸鼠、免疫缺陷鼠的重点监测病原体之一，以确保实验动物质量。牛棒状杆菌可通过培养法和分子生物学方法进行检测。牛棒状杆菌为革兰氏阳性菌，菌体短小、一端或两端膨大呈棒状，无鞭毛、无荚膜、无芽孢，兼性厌氧。分离培养时生长缓慢，分离困难，效率低，常造成漏检，不适用于大样本调查。直接从皮肤组织取样进行细菌分离培养，往往会因动物皮肤表面携带的其他微生物生长速度快，出现杂菌阻碍牛棒状杆菌生长甚至将其覆盖的现象，从而会造成漏检。PCR具备高效快速、操作简便等优势，近年来应用十分广泛，尤其在生长缓慢及苛养菌的检测中非常适用。但由于需要昂贵的扩增仪，且容易发生污染导致假阳性结果的出现等原因限制了该方法在一线现场的推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组检测牛棒状杆菌的引物及其试剂盒。本专利技术提供的特异性引物，特异性好，灵敏度高，能够实现牛棒状杆菌的快速检测。本专利技术提供了一组用于检测牛棒状杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述内引物对的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述环引物的序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光染料和权利要求1所述引物。优选的是，所述外引物的浓度分别为5μmol/L。优选的是，所述内引物的浓度分别为40μmol/L。优选的是，所述环引物的浓度分别为20μmol/L。优选的是，每25μL反应体系的试剂盒包括2×反应缓冲液12.5μL，权利要求1所述引物各1μL；BstDNA聚合酶1μL，荧光染料1μL。本专利技术提供了一组用于检测牛棒状杆菌的引物。本专利技术所述引物能够利用具有链置换活性的DNA聚合酶和引物特异性地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下保温几十分钟，即可完成核酸的扩增。本专利技术所述特异性引物特异性好，灵敏度高，对后续检测过程使用的仪器设备要求低，能够实现牛棒状杆菌的快速检测，适宜推广应用。试验结果表明，本专利技术所述引物用于检测牛棒状杆菌时最低检测线是118fg，在60min内即可完成牛棒状杆菌的检测。附图说明图1为本专利技术实施例2提供的扩增温度优化结果图；图2为本专利技术实施例3提供的特异性试验LAMP扩增图；图3为本专利技术实施例3提供的特异性试验可视化检测结果图；图4为本专利技术实施例3提供的特异性试验电泳检测结果图；图5为本专利技术实施例4提供的敏感性试验可视化检测结果图；图6为本专利技术实施例4提供的敏感性试验电泳检测结果图。具体实施方式本专利技术提供了一组用于检测牛棒状杆菌的引物，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述内引物对的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述环引物的序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术中，用于检测牛棒状杆菌的引物，根据GenBank公布的牛棒状杆菌16SrRNA序列设计，包括两条外引物、两条内引物和一条环引物。在本专利技术中，所述外引物的核苷酸序列具体为：F3正向外引物：5’-CTTTTGTGACGGTACCTGCA-3’(SEQIDNO.1)；B3反向外引物：5’-GCATTTCACCGCTACACCAG-3’(SEQIDNO.2)。在本专利技术中，所述内引物的核苷酸序列具体为：FIP正向内引物：5’-GGACAACGCTCGCACCCTACGAAGCACCGGCTAACTACG-3’(SEQIDNO.3)；BIP反向内引物：5’-CGTCTGTGAAATCCCGGGGCCAGTCTCCCCTACAGCACT-3’(SEQIDNO.4)。在本专利技术中，所述环引物的核苷酸序列具体为：LB反向环引物：5’-GCAGGCGATACGGGCAT-3’(SEQIDNO.5)。本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光染料和上述技术方案所述引物。在本专利技术中，所述反应缓冲液优选包括40mM的Tris-HCl(pH8.8)，20mM的KCl，16mM的MgSO4，20mM的(NH4)2SO4，0.2％(体积百分含量)的Tween20，1.6M的甜菜碱和2.8mM的dNTPs。在本专利技术中，所述荧光染料包括钙黄绿素、氯化锰。在本专利技术中，所述高黄绿素的浓度优选为0.5mM，所述氯化锰的浓度优选为10mM。在本专利技术中，所述外引物的浓度分别为5μmol/L。在本专利技术中，所述内引物的浓度分别为40μmol/L。在本专利技术中，所述环引物的浓度分别为20μmol/L。在本专利技术中，每25μL反应体系的试剂盒包括2×反应缓冲液12.5μL，上述技术方案所述引物各1μL；BstDNA聚合酶1μL，荧光染料1μL。在本专利技术中，所述反应体系在具体检测时，优选添加1μL的检测样品，水用于补足。本专利技术对所述水的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PCR用水即可。在本专利技术中，25μLLAMP反应体系具体如表1所示：表125μLLAMP反应体系组分浓度体积F35μmol/L1μLB35μmol/L1μLFIP40μmol/L1μLBIP40μmol/L1μLLB20μmol/L1μL2×反应缓冲液-12.5μLBstDNA聚合酶8U1μL荧光染料-1μL水-补足检测样品-1μL本专利技术所述试剂盒在使用时，优选按照上述配比将各组分混合后进行LAMP扩增。本专利技术所述试剂盒在用于牛棒状杆菌的检测时，所述检测的扩增程序优选为在60～65℃恒温下反应30～75min，更优选为在64℃恒温下反应60min。在本专利技术中，所述反应优选在等温扩增仪中进行。在本专利技术中，所述待测样品优选来自动物组织、分泌物或分离的菌种所提取的DNA。得到扩增产物后，本专利技术将所述扩增产物进行荧光染料目测观察或经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测分析。在本专利技术中，所述荧光染料目测观察法为：在LAMP反应结束后，显色结果观察到绿色荧光则判断为阳性，橙色则判断为阴性。在本专利技术中，所述琼脂糖凝胶电泳法为：取2μL扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，若出现L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于检测牛棒状杆菌的引物，其特征在于，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物的序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于检测牛棒状杆菌的引物，其特征在于，包括外引物对、内引物对和环引物；所述外引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述内引物对的序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述环引物的序列如SEQIDNO.5所示。2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒，包括：2×反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光染料和权利要求1所述引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯洁，谢建芸，高诚，
申请(专利权)人：上海实验动物研究中心，
类型：发明
国别省市：上海,31