一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法技术

本发明专利技术公开了一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法，载体包括目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体；然后将以上三种载体共转染目标细胞，转染后48h分别采用药物筛选或流式细胞分选快速富集基因修饰阳性细胞。最后，通过有限稀释法或单克隆挑取获得基因敲除细胞株。该方法采用双筛选标记，具有基因敲除效率高，筛选周期短，获得基因敲除细胞株快的优点，最大限度的缩短了获得基因敲除细胞株的时间，在基因功能研究领域具有重要意义。

A recombinant vector for rapid establishment of gene knockout cell line and its method

The present invention discloses a recombinant vector for rapid establishment of a gene knockout cell line and its method. The carrier includes the cutting carrier of the target gene cutting carrier, Donor carrier and Donor carrier, and then transfection of the three carriers to the target cells. After transfection, the 48h is selected by drug screening or flow cytometry to quickly enrich the gene. Positive cells. Finally, a gene knockout cell line was obtained by either limited dilution or monoclonal extraction. The method uses double screening markers, which has the advantages of high gene knockout efficiency, short screening cycle and fast gene knockout cell strain. It can shorten the time of obtaining gene knockout cell lines to the maximum extent. It is of great significance in the field of gene function research.

【技术实现步骤摘要】
一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法
本专利技术涉及分子生物学及遗传学前沿
，具体为一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法。
技术介绍
近年来，随着基因工程技术的发展，由TALEN技术、CRISPR/Cas9技术引领的针对特定基因、特定位点的精确修饰为人类解码基因功能、探索疾病致病机制提供可靠的技术手段。特别是随着CRISPR/Cas9系统的发现及工程化，使其成为当前基因工程领域功能最为强大的基因修饰工具。与传统的ES细胞基因打靶或敲除相比，基于CRISPR/Cas9系统的基因修饰技术，包括基因定点突变、基因敲除和外源基因定点插入等，表现出更具高效、快捷和广泛的应用前景。CRISPR/Cas9系统针对模式动物受精卵基因组的修饰，使其在短短几年内创造出数以千计的基因工程大鼠和小鼠。但是，在细胞基因修饰方面，由于很难针对单个细胞进行基因修饰并使其扩增建立细胞群，所以唯一可行的方案是针对细胞群进行基因修饰，然后从细胞群中筛选获得基因修饰阳性细胞并建立细胞株。由于进行处理的细胞众多，很难确定哪个细胞为阳性细胞，所以传统的做法是通过大量的单细胞分离培养，使其形成单克隆细胞群，然后进行大量的细胞基因型鉴定。这样的基因敲除细胞株的建立过程费时，费力，获得基因敲除细胞株比较困难。因此，为了满足对不同细胞、不同基因功能的研究，建立一种高效、快速的基因敲除阳性细胞的富集和筛选方法成为当前基因工程领域亟待解决的问题。
技术实现思路
针对传统基因敲除细胞制作方法的局限，为了使基因敲除细胞株的构建更加高效、快捷，借助CRISPR/Cas9系统，本专利技术提供了一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体及其方法。为达到上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体，包括目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体，其中：目的基因切割载体为带有针对目的基因设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体；Donor载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的EGFP和抗性基因表达载体；Donor载体的切割载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体。具体的，所述的针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列为GTGAACGTCTCCTAAAGCGTGTGG碱基序列。更具体的，所述的gRNA/Cas9表达载体可以为pX330载体，EGFP和抗性基因表达载体可以为pIRER2-EGFP载体。详细的，所述的目的基因切割载体为在gRNA/Cas9表达载体的U6启动子下游带有针对目的基因设计的gRNA的载体；所述的Donor载体为在EGFP和抗性基因表达载体Ndel酶切位点与多克隆位点之间带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的载体；Donor载体的切割载体为在gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的载体。还有，所述的针对目的基因设计的gRNA为针对目的基因的第一外显子DNA序列或第二外显子DNA序列设计的gRNA。更详细的，制备方法包括：(1)目的基因切割载体和Donor载体的切割载体的构建：分别针对目的基因和目的基因种属相异的非同源基因序列设计gRNA，依次命名为gRNA-A和gRNA-B，将gRNA-A连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游获得目的基因切割载体，将gRNA-B连接到gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游获得Donor载体的切割载体；(2)Donor载体的构建：设计gRNA-B引物序列得到gRNA-B正向引物和gRNA-B反向互补引物，gRNA-B正向引物和gRNA-B反向互补引物退火合成得到gRNA-B双链DNA，然后将gRNA-B双链DNA连接到EGFP和抗性基因表达载体的Ndel酶切位点与多克隆位点之间，即得Donor载体。还有，所述的gRNA-B的碱基序列为GTGAACGTCTCCTAAAGCGTG。还有，gRNA-B的正向引物序列为TATGGTGAACGTCTCCTAAAGCGTGTGGCTGCA，gRNA-B的反向互补引物序列为GCCACACGCTTTAGGAGACGTTCACCA。一种快速建立基因敲除细胞株的方法，包括采用所述的快速建立基因敲除细胞株的重组载体进行细胞目的基因的敲除，再对敲除目标基因的细胞进行克隆富集即得。该方法的步骤为：将目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体按照质量比为1:1:1的比例与脂质体混合转染目标细胞，再采用遗传霉素G418对转染后的目标细胞进行筛选，待在荧光显微镜下观察到绿色荧光细胞时，将绿色荧光细胞继续扩增培养，进一步通过流式细胞分选富集绿色荧光细胞，将绿色荧光细胞按照有限稀释法或克隆挑取法获得基因敲除细胞株。使用本专利技术进行细胞系基因敲除细胞株的构建，与传统方法相比具有以下优点：(1)高效，本方法借用donor载体上的EGFP和Neo双标记，首先通过G418快速杀死无基因修饰的野生型细胞，再通过流式细胞技术筛选绿色荧光蛋白表达阳性(GFP+)的细胞，能够高效的富集相同基因型的阳性的细胞；(2)省时，传统方法至少要用6-12个月甚至更长的时间缩短到2-3个月；(3)便捷，构建的基因敲除3质粒系统，除了针对目的基因的gRNA/Cas9载体外，其他两个载体均无需重新构建，能够快速进入细胞实验。附图说明图1为pX330-gRNA/Cas9载体结构示意图；图2为Donor载体构建示意图；图3为目标细胞基因敲除原理示意图；图4为目标细胞基因敲除细胞株建立流程；图5为Hul-7细胞Chop基因敲除细胞经G418初步筛选，基因敲除阳性细胞(GFP+)聚集，荧光显微镜下可见阳性逐渐富集；图6为Hul-7细胞Chop基因敲除细胞G418筛选末期流式细胞分析，基因敲除阳性细胞高达85.7％；图7为Hul-7细胞Chop基因敲除细胞系经有限稀释法获得单细胞克隆；图8为c/EBPα基因和c/EBPβ基因敲除细胞基因型鉴定；图9为c/EBPα基因敲除细胞克隆形成；图10为c/EBPβ基因敲除细胞克隆形成；以下结合说明书附图和具体实施方式对本专利技术做具体说明。具体实施方式名词解释：目的基因指的是待进行基因敲除的基因，包括实施例中的Chop、c/EBPA和C/EBPB等。目的基因种属相异的非同源基因指的是与目的基因种属来源不同，且基因同源性差异较大的基因，以人为例，即人待进行基因敲除基因的种属相异的非同源基因(比如，非同源的小鼠、大鼠基因等，本专利技术采用的是非同源的小鼠基因)。目的基因切割载体所带的gRNA的设计序列，与donor切割载体所带的gRNA的设计序列来自不同种属，同源性差异大，以避免Donor切割载体对目的细胞基因组的DNA进行切割。gRNA指的是guideRNA序列，即向导RNA序列。BbsI线性化的pX330载体为采用BbsI酶切后的pX330载体。Ndel和Pstl酶切pIRER2-EGFP载体骨架为经Ndel酶和Pstl酶共同酶切后得到的pIRER2-EGFP载体骨架。gRNA/Cas9表达载体为gRNA序列位于U6启动子下游的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，包括目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体，其中：目的基因切割载体为带有针对目的基因设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体；Donor载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的EGFP和抗性基因表达载体；Donor载体的切割载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，包括目的基因切割载体、Donor载体和Donor载体的切割载体，其中：目的基因切割载体为带有针对目的基因设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体；Donor载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的EGFP和抗性基因表达载体；Donor载体的切割载体为带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的gRNA/Cas9表达载体。2.如权利要求1所述的快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，所述的针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列为GTGAACGTCTCCTAAAGCGTGTGG碱基序列。3.如权利要求1所述的快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，所述的gRNA/Cas9表达载体可以为pX330载体，EGFP和抗性基因表达载体可以为pIRER2-EGFP载体。4.如权利要求1、2或3所述的快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，所述的目的基因切割载体为在gRNA/Cas9表达载体U6启动子下游带有针对目的基因设计的gRNA的载体；所述的Donor载体为在EGFP和抗性基因表达载体Ndel酶切位点与多克隆位点之间带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA/Cas9靶序列的载体；Donor载体的切割载体为在gRNA/Cas9表达载体的U6启动子下游带有针对目的基因种属相异的非同源基因序列设计的gRNA的载体。5.如权利要求1、2或3所述的快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，所述的针对目的基因设计的gRNA为针对目的基因的第一外显子DNA序列或第二外显子DNA序列设计的gRNA。6.如权利要求1、2或3所述的快速建立基因敲除细胞株的重组载体，其特征在于，制备方法包括：(1)目的基因切割载体和Donor...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐娟，王建超，李一鸣，陈志南，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61