一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其包括有以下步骤，具体的：a、引物设计；b、MTAl基因的扩增；c、pIRES2‑MTAl真核表达载体的构建；d、pIRES2‑MTAl真核表达载体的鉴定。通过上述方法设计，本发明专利技术能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。

Construction and identification of a MTA1 gene expression vector

The invention discloses a method for the construction and identification of MTA1 gene expression vector, which includes the following steps: A, primer design, amplification of B and MTAl genes, construction of C, pIRES2 MTAl eukaryotic expression vector, and identification of D, pIRES2 MTAl eukaryotic expression vector. By designing the above method, the invention can clone MTAl gene and construct eukaryotic expression vector, which can lay a foundation for further research.

【技术实现步骤摘要】
一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法
本专利技术涉及基因表达载体构建
，尤其涉及一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法。
技术介绍
通过使用差异cDNA文库筛选技术，Pencil等首次从具有不同转移潜能的13762NF鼠乳腺癌细胞株中分离出一种新的与乳腺癌转移相关的基因，之后经过同源性检测发现，在高转移潜能的人乳腺癌细胞系中，也存在着同源物，并且其表达情况和乳腺癌的侵袭转移能力呈现出正相关，故被命名为肿瘤转移相关基因1，即MTA1。MTA1广泛表达于乳腺癌、卵巢癌、食管癌、胃肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织中，并且其表达水平在肿瘤的转移、浸润及复发中起着非常重要的作用。MTA1基因定位于染色体14q32.3，基因全长2.3kb，cDNA全长2756bp，编码含715个氨基酸残基的蛋白，相对分子量约80kd。MTA1主要由四个保守结构域组成，如BMH结构域（bromo-adjacenthomology）、egl-27、ELM2结构域（MTA1homologydomain2）、SANT结构域（Swi3,Ada2,NCoRandTFIIIBdomain）、GATA样锌指模体，这些结构可能对恶性肿瘤的转移、侵袭有一定的作用，但具体原因不明。MTAl和其同源基因-MTA2、MTA3均属于核小体重构与组蛋白脱乙酰复合物nucleosomeremodel-ingandhistonedeacetylase,NuRD）的重要组成部分。MTAl与NuRD复合物中的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）相互作用，通过染色体区域组蛋白的乙酰化与脱乙酰化来调控靶基因的转录，从而参与肿瘤的发生发展及浸润转移。Higashijima等利用免疫组化的方法检测结直肠癌患者临床标本中的MTAl和HDAC1的表达及分析患者的5年生存率，结果发现MTAl和HDAC1的表达水平可以作为判断结直肠癌预后的指标。正常的成人组织中，除大脑、肝、肾，心肌外，MTAl基因呈低水平的表达，然而在多种具有高转移能力的恶性肿瘤中呈现高表达。最早的研究证实，具有高转移能力乳腺癌细胞株MTAl基因的表达水平是无转移能力细胞株的4倍，提示癌细胞的转移与其表达的MTAl基因的水平有密切关系。近年来研究发现，在乳腺癌细胞中高表达的MTAl基因和HDACs共同介导抑制雌激素受体（ER）的转录，而ER的减少或消失与乳腺癌的形成以及恶性程度有关。有研究报道，也高表达于卵巢癌组织MTA1中。田菁等进一步研究发现，不同FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及不同病理分级的卵巢癌组织中，MTA1的表达与FIGO分期期别呈正相关；与卵巢癌组织学分化程度呈负相关。该结果提示，MTA1的高表达在肿瘤恶性增殖、浸润转移中起到重要作用。在消化道肿瘤中，如食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌及胰腺癌等癌组织中，研究发现MTAl蛋白的过表达与食管癌、胃癌及结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移以及预后差密切相关。最近的研究表明，MTA1在上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）中起着重要的作用，其可以通过诱导EMT使结直肠癌细胞的浸润转移能力增强。另外，有研究报道，MTA1通过结合FosB/HDAC2复合物的部分启动子使E-cadherin的表达下调，最终导致EMT，从而增强癌细胞的浸润与侵袭能力。总之，MTA1的过表达确实与诸多恶性肿瘤的形成、浸润转移有着密不可分的相关性；但是，具体分子机制仍待深入研究阐明。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，该MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，包括有以下步骤，具体的：a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据MTAl开放阅读框架序列设计特异性引物，扩增产物的总长度约为2186bp；MTAl引物序列：上游引物为5'-CGGAATTCATGGCCGCCAACATGTAC-3'，且上游引物引入EcoRI位点；下游引物为5'-CGGGATCCCTAGTCCTCGATGACGATG-3'，且下游引物引入BamHI位点；上游引物的GAATTC为保护碱基，下游引物的GATCCC酶切位点；b、MTAl基因的扩增：SW480细胞用RPM1640完全培养基置于5%CO237℃培养，取对数生长期细胞作为实验用，收集细胞，采用TRIzol一步法提取SW480细胞总RNA，参照逆转录试剂盒的标准要求合成cDNA用作PCR反应模板；c、pIRES2-MTAl真核表达载体的构建：将真核表达载体pIRES2-eGFP与目的基因MTAl回收产物分别同时进行双酶切，目的基因MTAl酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，将真核表达载体pIRES2-eGFP酶切产物跑胶，凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物用T4DNA连接酶连接；d、pIRES2-MTAl真核表达载体的鉴定：将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，用转化的DH5α感受态菌液涂布于含30mg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-16h，长出的单个菌落即为转化的菌落，挑取单克隆，在含30mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养12-16h；菌液用碱裂解法小量提取质粒DNA，PCR扩增质粒上的目的基因，凝胶电泳鉴定扩增产物。其中，于所述步骤b中，PCR反应体系容量为50μL，包括2×PowerTaqPCRMasterMix25μL，上下游引物各加2.5μL，cDNA5μL，无菌去离子水补至50μL；反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性45sec，55℃退火1min，72℃延伸2.5min，扩增35个循环，最后72℃延伸7min。其中，于所述步骤c中，双酶切反应体系容量为50μL，包括RestrictionEnzymeEcoRI和BamHI各1μL，10×NEBBuffer5μL，DNA1μg，无菌去离子水补至50μL。其中，于所述步骤c中，连接反应体系容量为10μL，包括T4DNALigase1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，MTAl和pIRES2-eGFP为10∶1，置于PCR仪上6℃连接过夜。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其包括有以下步骤，具体的：a、引物设计；b、MTAl基因的扩增；c、pIRES2-MTAl真核表达载体的构建；d、pIRES2-MTAl真核表达载体的鉴定。通过上述方法设计，本专利技术能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。附图说明下面利用附图来对本专利技术进行进一步的说明，但是附图中的实施例不构成对本专利技术的任何限制。图1为PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳并于紫外线透射仪下观察电泳结果；图2为plRES-MTA1双酶切鉴定结果。图3为pIRES2-MTA1部分测序结果。具体实施方式下面结合具体的实施方式来对本专利技术进行说明。一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，包括有以下步骤，具体的：a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据MTAl开放阅读框架序列设计特异性引物，扩增产物的总长度约为2186bp；MTAl引物序列：上游引物为5'‑CGGAATTCATGGCCGCCAACATGTAC‑3'，且上游引物引入EcoR I位点；下游引物为5'‑CGGGATCCCTAGTCCTCGATGACGATG‑3'，且下游引物引入BamH I位点；上游引物的GAATTC为保护碱基，下游引物的GATCCC酶切位点；b、MTAl基因的扩增：SW480细胞用RPM1640完全培养基置于5% CO2 37℃培养，取对数生长期细胞作为实验用，收集细胞，采用TRIzol一步法提取SW480细胞总RNA，参照逆转录试剂盒的标准要求合成cDNA用作PCR反应模板；c、pIRES2‑ MTAl真核表达载体的构建：将真核表达载体pIRES2‑eGFP与目的基因MTAl回收产物分别同时进行双酶切，目的基因MTAl酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，将真核表达载体pIRES2‑eGFP酶切产物跑胶，凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物用T4 DNA连接酶连接；d、pIRES2‑ MTAl真核表达载体的鉴定：将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，用转化的DH5α感受态菌液涂布于含30 mg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养12‑16 h，长出的单个菌落即为转化的菌落，挑取单克隆，在含30mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养12‑16 h；菌液用碱裂解法小量提取质粒DNA，PCR扩增质粒上的目的基因，凝胶电泳鉴定扩增产物。...

【技术特征摘要】
1.一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据MTAl开放阅读框架序列设计特异性引物，扩增产物的总长度约为2186bp；MTAl引物序列：上游引物为5'-CGGAATTCATGGCCGCCAACATGTAC-3'，且上游引物引入EcoRI位点；下游引物为5'-CGGGATCCCTAGTCCTCGATGACGATG-3'，且下游引物引入BamHI位点；上游引物的GAATTC为保护碱基，下游引物的GATCCC酶切位点；b、MTAl基因的扩增：SW480细胞用RPM1640完全培养基置于5%CO237℃培养，取对数生长期细胞作为实验用，收集细胞，采用TRIzol一步法提取SW480细胞总RNA，参照逆转录试剂盒的标准要求合成cDNA用作PCR反应模板；c、pIRES2-MTAl真核表达载体的构建：将真核表达载体pIRES2-eGFP与目的基因MTAl回收产物分别同时进行双酶切，目的基因MTAl酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，将真核表达载体pIRES2-eGFP酶切产物跑胶，凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物用T4DNA连接酶连接；d、pIRES2-MTAl真核表达载体的鉴定：将连接产物转化入E.coliDH5α感受态细胞，用转化的DH5α感受态菌液涂布于含...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱伟，尹金宝，曾超，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44