一种通过延迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过延迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法，具体为通过推迟猪胚胎早期成肌决定基因MyoD表达时间，使得胚胎早期初级肌纤维形成时间推后，增加肌纤维总数，从而提高出生后产肉量（瘦肉产量）。本发明专利技术首先研究发现，产肉量较多的猪myoD表达较晚，而且出现初级肌纤维时间也较晚，因此成肌细胞有更多的时间增殖，分化后产生的肌纤维数量比产肉量少的猪种多，最终在出生后产肉量也就更多。基于这一重要发现，本发明专利技术可以通过生物技术手段来影响甚至是改变动物体内MyoD的表达时间，从而获得产肉量多的畜禽新品种。

A way to increase pig lean meat yield by delaying gene expression time

The present invention discloses a method of raising pig lean meat production by delayed gene expression time, specifically by postponing the expression time of the early myogenic MyoD gene of the pig embryo, pushing the early primary muscle fiber formation time of the embryo, increasing the total number of muscle fibers, and raising the yield of lean meat (lean meat production) after birth. The first study found that the pig myoD with more meat production was later expressed, and the time of primary muscle fiber appeared later, so myoblasts had more time to proliferate, and the number of muscle fibers produced after differentiation was much more than that of pigs producing less meat, and more meat was produced after birth. Based on this important discovery, the invention can influence and even change the time of expression of MyoD in the animal body by means of biological technology, so as to obtain a new breed of livestock and poultry with more meat production.

【技术实现步骤摘要】
一种通过延迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法
本专利技术涉及分子遗传
，具体地，涉及一种通过延迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法。
技术介绍
猪的骨骼肌发育在胚胎期主要有两轮：1）初级肌纤维的形成阶段，妊娠后第14～22天是体节的发育，随后轴旁中胚层发育形成生肌节，初级肌纤维在妊娠后第35天左右开始出现，在妊娠第49天左右达到增殖高峰，并一直持续到妊娠第60天。2）次级肌纤维形成阶段，妊娠第45~90天左右次级肌纤维围绕初级肌纤维周围分化发育，并在妊娠75天左右达到高峰，妊娠第91天之后，肌纤维数目基本不再改变，肌纤维在出生后主要进行肌纤维的肥大以及类型变化的成熟过程。因此，猪胚胎期骨骼肌的肌纤维总数在出生前就已经确定。前人研究发现，肌纤维数目和大小是产肉量的主要决定因素，这其中，肌纤维数目更加重要，因为大小适中的肌纤维比例较高的动物会产生更多的瘦肉和较好的的肉，并且肌纤维数目越多，动物个体生长的速度就越快越高效。比较大白和长白猪杂交后子一代不同大小的胚胎，发现初级肌纤维出现的时间没有差异，但是体型小的猪胚胎次级肌纤维的数量要显著少于体型大的胚胎，并且在出生后有17%的肌纤维总数的差异。因此在同一品种内，次级肌纤维可能对总肌纤维数目的影响更大。不同品种猪之间的比较，体型较大的大白猪初级肌纤维的数目以及次级肌纤维与初级肌纤维的比例都显著高于小型猪。因此，在不同体型猪品种间，初级肌纤维可能对总肌纤维数目的影响更大。综上所述，初级肌纤维在产肉量不同的猪种中，对出生后的产肉量起到决定性的作用。成肌调控因子家族是成肌过程中起决定性作用的基因家族。该家族有四个成员：MyoD、Myf5、Myogenin和MRF4，其共同特征是拥有一个具有成肌调控潜力的高度保守的碱性螺旋环螺旋结构作用域。四个成员当中，Myf5在胚胎中最先表达，并与MyoD相互补充来作为成肌的起始决定基因。有研究发现缺失上述两个基因的转基因小鼠不会形成任何肌肉，但单独缺失上述两者中的任意一个基因，对成肌均不会有太大的影响，说明Myf5和MyoD有一定的功能重叠和互补。在对敲除MyoD小鼠中分离的成肌细胞进行研究发现，敲除MyoD的成肌细胞会增殖更长的时间，导致分化的延迟。最近的研究结果显示，MyoD与Myf5结合下游基因的位点几乎一致，但与MyoD相比，Myf5缺少一个较强的激活作用域，因此没有MyoD那么强的引起下游基因表达的能力。赵晓等在2011年，利用广东地方猪种蓝塘猪和国外瘦肉型长白猪胚胎35天到出生后180天的背最长肌组织进行了形态观察和转录组测序。结果发现，蓝塘猪在胚胎35天就已经出现了初级肌纤维，而长白猪到了胚胎49天才出现初级肌纤维，但是在之后的肌肉发育过程中，蓝塘猪肌肉发育要慢于长白猪，并且出生后产肉量也低于后者。通过转录组测序，他们发现成肌决定因子在蓝塘猪胚胎早期要比长白猪更早更多的表达，这其中就包括MyoD基因。2015年，YuqiangZhao等人比较研究了另外一种华中地区的地方猪种通城猪与西方瘦肉猪种约克夏猪（大白猪）胚胎30天直到出生后5周的背最长肌组织。与蓝塘猪情况类似，组织形态学发现，产肉量较少的通城猪同样在胚胎期30天比约克夏猪拥有较多数量和较高密度的成肌细胞，但是在之后的第二轮肌肉发育中，约克夏猪的次级肌纤维的发育速度要快于通城猪。猪胚胎期初级肌纤维的数量决定了肌纤维总数，而肌纤维总数又会影响出生后的产肉量，同时肌纤维总数在胚胎期已经确定，因此猪胚胎期初级肌纤维的发育对出生后产肉量具有决定性影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种通过延迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：延迟猪胚胎期成肌分化因子MyoD的表达时间在提高猪产肉量中的应用。一种通过延迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法，延迟猪胚胎期成肌分化因子MyoD的表达时间，从而提高猪产肉量。优选地，推迟MyoD基因在猪中表达1周以达到增加产肉量的效果。本专利技术在小鼠来源的C2C12成肌细胞系中模拟了中国地方猪种中MyoD基因早表达的情况，分别提前MyoD基因表达48h和24h，均使分化产生的肌管数量减少，并且越早表达产生的肌管数量越少。在实际应用中，我们根据瘦肉型长白猪比小型猪五指山猪MyoD晚表达一周的实际结果，推迟MyoD基因在猪中表达1周以达到增加产肉量的效果。本专利技术使用产肉量依次递减的长白、蓝塘和五指山猪胚胎早期18、21、28、32、35和42天的背最长肌肉样组织进行组织形态学观察及肌管标志蛋白检测，我们发现三个品种猪初级肌纤维出现的时间存在差异：五指山猪在胚胎32天首先出现初级肌纤维，蓝塘和长白猪在胚胎35天出现初级肌纤维，而此时蓝塘猪的初级肌纤维数量显著高于长白猪。通过对上述样品进行转录组测序、定量PCR和Westernblot分析，我们发现MyoD在产肉量最少的五指山猪中表达最早、最高（胚胎21天开始表达），而在产肉量最多的长白猪中表达最晚、最低（胚胎28天开始表达）。为了验证myoD表达时间对成肌的影响，我们在C2C12和NIH3T3细胞系中通过过表达MyoD质粒来验证MyoD的表达以及表达时间是否会影响最终分化的肌纤维数量，而结果完全符合预期，即在两种细胞系中过表达MyoD均会抑制细胞的增殖，分化后产生的肌管减少。基于这一重要发现，我们可以通过生物技术手段来影响甚至是改变动物体内MyoD的表达时间，从而获得产肉量多的畜禽新品种。实现推迟表达MyoD的方法有在地方猪种中利用dox诱导的Cre-LoxP敲入MyoD基因的技术。通过Cre-LoxP猪与CRISPR-Cas9技术构建的MyoD敲入猪杂交得到的MyoD-LacZ-Stop-Cas9-KI猪，在不同的胚胎时期对母猪饲喂dox，诱导MyoD基因表达的时序，使地方猪种MyoD基因表达时间推迟。此外还有利用慢病毒介导的RNA干扰技术，即构建MyoD基因的慢病毒干扰载体，在不同胚胎时期对地方猪种的母猪注射慢病毒干扰载体从而推迟MyoD的表达时间。这些方法的结果就是使成肌细胞有更多的时间增殖，进而分化出更多肌纤维，提高地方猪种的瘦肉产量。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术首次发现：产肉量较多的猪MyoD表达较晚，而且出现初级肌纤维时间也较晚，因此成肌细胞有更多的时间增殖，分化后产生的肌纤维数量比产肉量少的猪种多，最终在出生后产肉量也就更多。基于这一重要发现，本专利技术可以通过生物技术手段来影响甚至是改变动物体内MyoD的表达时间，从而获得产肉量多的畜禽新品种。附图说明图1是三品种猪胚胎早期初级肌纤维出现时间存在差异的实验验证图；A.HE染色，400×；B.免疫组化，400×；C.初级肌纤维的数量统计；D.三品种猪胚胎背最长肌组织免疫蛋白印迹结果；免疫组化，WB实验抗体为MYHC，内参为GAPDH,箭头所指为初级肌纤维；标尺=50μm；*，p<0.05；**，p<0.01。图2是三品种猪胚胎五个时期影响成肌的主要基因/miRNA的转录组测序结果。（A-B）MRFs与MEFs家族基因；（C）成肌分化时期的标志基因；（D）抑制成肌的基因；（E）促进成肌的成肌特本文档来自技高网...

【技术保护点】
推迟猪胚胎期成肌分化因子MyoD的表达时间在提高猪产肉量中的应用。

【技术特征摘要】
1.推迟猪胚胎期成肌分化因子MyoD的表达时间在提高猪产肉量中的应用。2.一种通过推迟基因的表达时间来提高猪瘦肉产量的方法，其特征在于，推迟猪胚胎期成肌分化因子MyoD的表达时间，从而提高猪产肉量。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，推迟MyoD基因在猪中表达1周以达到增加产肉量的效果。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述推迟猪胚胎期成肌分化因子MyoD的表达时间的的方法如下：在地方猪种中利用do...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫德林，张续勐，陈瑶生，刘小红，何祖勇，丛佩清，邱柏钦，郭慈琳，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44