一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法技术

本发明专利技术公开一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其利用shRNA技术控制乳酸代谢通路上关键酶的转录，具体步骤包括：1)构建含有待表达蛋白序列的质粒和含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒；2)将步骤1)中构建的质粒通过转染的方法引入CHO细胞中；3)对步骤2)中转染后细胞进行抗生素筛选；4)待细胞状态恢复后，采用步骤3)筛选后的细胞生产目标蛋白；所述表达乳酸代谢通路上关键酶包括乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶。本发明专利技术所提供的方法与传统CHO细胞群生产中需要对pH进行密切监测并不断通过加入碱来调节相比，此发明专利技术仅仅在转染时同时额外共同转染数个shRNA质粒，不但操作复杂程度大幅降低，而且对乳酸降低进而最终蛋白产量提高有较大的保障。

A method to increase the expression of CHO cell protein

The invention discloses a method for increasing CHO cells protein expression method, the key enzyme lactic acid metabolic pathway on transcription of shRNA technology, the specific steps include: 1) to construct plasmid containing the expression plasmid containing protein sequence and expression of the key enzyme of lactic acid metabolic pathway on shRNA; 2) in step 1). In the construction by transfection method into CHO cells; 3) to step 2) stained cells transfer antibiotic screening; 4) to cell state recovery after the step 3) cell production target protein after screening; the expression of the key enzyme of lactic acid metabolic pathway including lactate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase kinase. The need for close monitoring of pH and continue by adding alkali to adjust the compared method provided by the invention and the traditional CHO cell group in the production of this invention only in transfection and additional number of CO transfected shRNA plasmid, not only the operation complexity is reduced greatly, but also to reduce and ultimately improve the yield of lactic acid protein has great security.

【技术实现步骤摘要】
一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法
本专利技术涉及生物制药领域，特别是涉及采用CHO(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞)细胞表达蛋白的方法。
技术介绍
随着制药行业的蓬勃发展，大规模CHO细胞蛋白生产的需求日益增加。细胞群批次补料可以在较短时间内提供克级以上蛋白用于研发等用途，因此其应用越来越广泛。批次补料过程中，各种代谢废物也在培养体系中不断堆积，造成细胞周围环境逐渐恶化，细胞活率降低，导致细胞蛋白比生产率降低，直接影响蛋白最终产量。乳酸作为一种主要代谢副产物，对细胞培养体系pH有显著影响。过多的乳酸堆积会造成整个体系pH大幅降低进而影响细胞蛋白表达。在生物反应器中，pH通常可以通过在线监测并添加碱来得到有效的控制，然而过多碱的添加会造成培养体系渗透压的增加，同样不利于细胞蛋白表达。对于更加常见的摇瓶表达，pH无法实时监控，乳酸堆积对蛋白表达的影响更加显著。通过工艺的精细控制有时可以缓解乳酸堆积现象，然而需要耗费较多的人力物力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其能够有效降低蛋白表达过程中乳酸堆积现象，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其特征在于，利用shRNA技术控制乳酸代谢通路上关键酶的转录，具体步骤包括：1)构建含有待表达蛋白序列的质粒和含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒；2)将步骤1)中构建的质粒通过转染的方法引入CHO细胞中；3)对步骤2)中转染后细胞进行抗生素筛选；4)待细胞状态恢复后，采用步骤3)筛选后的细胞生产目标蛋白；所述表达乳酸代谢通路上关键酶包括乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶。

【技术特征摘要】
1.一种增加CHO细胞群蛋白表达量的方法，其特征在于，利用shRNA技术控制乳酸代谢通路上关键酶的转录，具体步骤包括：1)构建含有待表达蛋白序列的质粒和含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒；2)将步骤1)中构建的质粒通过转染的方法引入CHO细胞中；3)对步骤2)中转染后细胞进行抗生素筛选；4)待细胞状态恢复后，采用步骤3)筛选后的细胞生产目标蛋白；所述表达乳酸代谢通路上关键酶包括乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过抑制乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶激酶中的至少一种从而达到降低乳酸的效果。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，含有表达乳酸代谢通路上关键酶的shRNA的质粒是将表达乳酸代谢通路上关键酶所对应的shRNA序列以及相应的启动子构建至质粒上。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该质粒还包含抗生素基因用于筛选。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，使用去内毒素的质粒抽提试...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹃，张峥，蔡洁行，周伟昌，陈智胜，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，无锡药明康德生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31