内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法：首先，获得CCR5

The construction method of the conditional knockout of CCR5 gene in the mouse model of endothelial cells

The invention discloses a method for constructing a mouse model of endothelial cell conditioned knockout CCR5 gene: first, to obtain CCR5

【技术实现步骤摘要】
内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法
本专利技术涉及一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，属于动物模型及其应用领域。
技术介绍
趋化因子受体CCR5(chemokinereceptor5)是一类G蛋白7次跨膜受体，分子量约为40.6KDa，由352个氨基酸残基组成，结构上可分为：胞外N末端、3个胞外环(extracellularloop)区域(ECL1、ECL2、ECL3)、3个胞内环区域、7个跨膜α螺旋和胞内C末端(SzpakowskaM,PerezBercoffD,ChevigneA.Closingthering:afourthextracellularloopinchemokinereceptors.Sciencesignaling,2014,7(341):pe21.)，主要表达在单核细胞和某些T细胞亚群。CCR5的配体主要为趋化因子CCL3(chemokineC-Cmotifligand3)、CCL4(chemokineC-Cmotifligand4)和CCL5(chemokineC-Cmotifligand5)。CCR5作为一种G蛋白偶联受体，通过胞外环与配体结合后，使G蛋白上α亚基与β、γ亚基分离，变为激活状态，激活下游信号通路，参与机体生理与病理调节过程如刺激淋巴细胞增生，调节巨噬细胞侵润和MI/M2型极化等。高糖条件下，CCR5在单核/巨噬细胞中表达明显升高，高浓度水平的CCR5可促进巨噬细胞侵润，加重机体炎症反应。长期以来，CCR5一直被看作是调控巨噬细胞迁移、加重糖尿病微血管损伤的重要因子。然而我们前期研究发现：CCR5基因功能性缺失会导致糖尿病患者微血管并发症发病风险增加(ZhangZW,ZhangXQ,DongJJ,etal.AssociationofCCL5/CCR5genepromoterpolymorphismswithdiabeticmicrovascularcomplications:Ameta-analysis.Journalofdiabetesinvestigation,2016,Mar；7(2):212-8.)，我们进一步研究证实，CCR5不仅表达于单核/巨噬细胞中，也特异性表达于内皮/内皮祖细胞中，敲除CCR5虽然能减轻炎症反应，但是也加重了内皮损伤(ZhangZ,DongJ,LobeCG,etal.CCR5facilitatesendothelialprogenitorcellrecruitmentandpromotesthestabilizationofatheroscleroticplaquesinApoE-/-mice.StemCellResearch&Therapy,2015,6(1):36.)，而内皮细胞特异表达的CCR5是组织血管再生的重要调节因子。与CCR5基因沉默的细胞相比，表达CCR5基因的内皮祖细胞有更强的促血管生成能力。靶向敲除CCR5会导致内皮祖细胞向受损部位聚集减少，促血管生成因子VEGF表达量降低，皮肤损伤愈合延迟(IshidaY,KimuraA,KuninakaY,etal.PivotalroleoftheCCL5/CCR5interactionforrecruitmentofendothelialprogenitorcellsinmousewoundhealing.TheJournalofclinicalinvestigation,2012,122(2):711-721.)。我们前期研究进一步证实，高糖条件下，小鼠微血管内皮细胞中转染CCR5表达质粒后，细胞促血管新生能力增强，而靶向敲除CCR5后这一促血管新生能力又被明显抑制。上述证据提示CCR5在巨噬/内皮细胞的功能存在异质性，CCR5是介导微血管内皮细胞发挥血管新生功能的关键分子。基于CCR5在不同的细胞中具体独特的调控机理和特异的功能活性，有必要构建一种动物模型以便于实验和研究，但是国内外尚无CCR5条件性敲除鼠的构建，也无人开展在内皮细胞特异性敲除CCR5的研究。申请人首次证实CCR5在巨噬/内皮细胞中存在“双刃剑”作用，该动物模型一旦构建成功，能为研究CCR5在内皮细胞特异性奠定技术基础，阐明CCR5同一基因在不同细胞、组织中存在异质性，为下一步干预或减缓微血管并发症的进展提供精准分子靶点，符合精准医学的范畴。因此，本专利技术拟构建条件性内皮细胞基因敲除小鼠，在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使CCR5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的组织器官，最大限度达到机理研究的可控性，克服了常规基因敲除术不区分不同组织或细胞，在小鼠体内行所有组织或细胞剔除靶基因的弊端。本专利技术现就条件性内皮细胞CCR5基因敲除小鼠制备及繁育方法进行详细的介绍和探讨。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法。本专利技术填补了现有技术在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因小鼠的空缺，为微血管病变的机制研究提供一个可信的小鼠模型及该小鼠模型的制备方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法：首先，获得CCR5loxp/loxp小鼠，然后与Tie-2-cre/ERT2小鼠(携带有Tie2-Cre基因的Cre工具小鼠，该品系小鼠的Cre重组酶由小鼠内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie2启动子驱动，经他莫昔芬诱导可在内皮细胞中特异表达Cre重组酶)交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠(CCR5flox/+,Cre)，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠(CCR5flox/flox,Cre)；其中，CCR5loxp/loxp小鼠的构建方法包括以下步骤：(1)使用显微注射仪将Cas9mRNA、gRNA和DonorDNA按一定浓度比例混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则Cas9蛋白在gRNA的靶向作用下对CCR5基因的DNA双链进行切割(如图5所示)，从而诱发同源重组修复机制以DonorDNA为模板对损伤的CCR5基因进行修复，将LoxP序列整合到小鼠基因组中的特定位点；然后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，通常注射150～200枚受精卵，并移植到2只假孕母鼠中；所述gRNA的序列为：上游靶点：CCR5-L4：GGGTGCTAATTACTGTTCTA；反向互补序列：TAGAACAGTAATTAGCACCC；下游靶点：CCR5-R：GAAGAAAGTTTTACGGTTGT；所述DonorDNA的序列如SEQIDNO.20所示；(2)上述胚胎移植的小鼠出生后，选取雄性的5’端和3’端均有FloxP插入的小鼠，待7周龄后，与野生型异性小鼠(C57BL/6雌性小鼠)交配，得到F1代loxp杂合子小鼠(CCR5flox/+)；(3)将上述F1代loxp杂合子小鼠进行相互近交，得到F2代小鼠，从F2代小鼠中选取CCR5loxp纯合子小鼠(CCR5flox/flox)，CCR5loxp纯合子小鼠相互近交产生F3代，得到稳定的CCR5loxp纯合子小鼠品系。本专利技术的内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，是在小鼠体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：首先，获得CCR5

【技术特征摘要】
1.一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：首先，获得CCR5loxp/loxp小鼠，然后与Tie-2-cre/ERT2小鼠交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠；其中，CCR5loxp/loxp小鼠的构建方法包括以下步骤：(1)将Cas9mRNA、gRNA和DonorDNA混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则Cas9蛋白在gRNA的靶向作用下对CCR5基因的DNA双链进行切割，从而诱发同源重组修复机制以DonorDNA为模板对损伤的CCR5基因进行修复，将LoxP序列整合到小鼠基因组中的特定位点；然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：张钟文，廖琳，董建军，吴红霞，张瀚允，
申请(专利权)人：山东省千佛山医院，
类型：发明
国别省市：山东,37