果蝇S2细胞瞬时转染的方法技术

本发明专利技术涉及一种果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其包括如下配置转染试剂溶液、配置转染复合物及瞬时转染等步骤。该果蝇S2细胞瞬时转染的方法使用几丁聚糖作为转染试剂，转染效率较之多聚赖氨酸、脂质体或磷酸钙等转染试剂有明显提高，蛋白产品也显著提高。在分析含目的DNA的质粒与转染试剂形成的转染复合物的大小后发现，几丁聚糖与含目的DNA的质粒形成的转染复合物最小。几丁聚糖作为转染试剂具有价格低廉、操作简单且转染后蛋白产量较高的优点，可适用于果蝇S2细胞的大规模瞬时转染，可在较低成本短时间内获得大量重组蛋白。

The method of transient transfection of S2 cells in Drosophila melanogaster

The present invention relates to a method of transient transfection of S2 cells in Drosophila melanogaster, which includes the following steps, such as the configuration of the solution of the transfection reagent, the configuration of the transfection complex and the transient transfection. The method of transient transfection of Drosophila S2 cells, using chitosan as a transfection reagent, has a significantly higher transfection efficiency than that of poly (lysine, liposomes or calcium phosphate), and the protein product is also significantly improved. After analyzing the size of transfection complex formed by plasmid containing DNA and transfection reagent, it was found that chitosan and DNA containing plasmids had the lowest transfection complex. Chitosan as a transfection reagent has the advantages of low cost, simple operation and high protein yield after transfection. It can be applied to large-scale transient transfection of Drosophila S2 cells, and it can get a lot of recombinant protein in a relatively low cost and short time.

【技术实现步骤摘要】
果蝇S2细胞瞬时转染的方法
本专利技术涉及生物工程领域，尤其是涉及一种果蝇S2细胞瞬时转染的方法。
技术介绍
昆虫细胞表达系统已被广泛用于包括组织因子和抗体等在内的众多人类重组蛋白的表达(Kosr等，1997)。目前，昆虫表达系统主要用于表达亚单位疫苗，包括兽用疫苗以及部分人类疫苗及重组病毒(Maranga等，2002；Ryan和walsh等，2012；Yang等，2013；Miller等，2012)。果蝇S2(DrosophilaSchneider2)细胞是一种常用于异源基因表达的双翅目果蝇科果蝇属的昆虫细胞，可通过构建稳定细胞池的方法进行重组蛋白表达，近年来已成功用于表达一些具有生物活性的受体蛋白、离子通道蛋白、细胞骨架蛋白、转录因子、激素和凝血因子等(Millar等，1995；Millar等，1994；Tota等，1995；Towers和Sattelle等，2002；Mennella等，2005；Winslow等，1989；Change等，2005；Zmora等，2007；Vatandoost等，2012)。但稳定细胞池的生产过程耗时长达几个月并且产量很低，每升的产量只能达到几毫克。瞬时转染在哺乳动物中用于重组蛋白的快速表达的工艺已非常完善，近年来也逐渐应用到昆虫表达系统中(Geisse等，2009；Hopkins等，2012；Loomis等，2005；Shen等，2013)。但由于表达量低和没有找到高效低成本的的转染试剂等原因，果蝇S2细胞的瞬时转染目前只用于构建稳定细胞株之前对表达载体的检验(Vatandoost等，2012)。果蝇S2细胞的瞬时转染常用的转染试剂为磷酸钙或脂质体，操作繁琐、价格昂贵，不利于工艺放大，使其应用受到了限制(Cherbas等，2007)。目前还没有低成本的阳离子聚合物转染试剂在果蝇S2细胞转染中的应用(Hacker等，2013)。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种成本低且转染效率高的果蝇S2细胞瞬时转染的方法。一种果蝇S2细胞瞬时转染的方法，包括如下步骤：配置转染试剂溶液：将几丁聚糖溶于pH3-10无菌水中，配置成浓度为0.1-10g/ml的转染试剂溶液；配置转染复合物：按照几丁聚糖与待转染的含目的DNA的质粒的质量比为1-20:1的比例将所述转染试剂溶液与待转染的含目的DNA的质粒溶液加入无菌水中，震荡混匀，形成转染复合物；瞬时转染：将所述转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中，摇晃培养，得到已转染含目的DNA的质粒的果蝇S2细胞。在其中一个实施例中，所述几丁聚糖的分子量范围为50-300kD。在其中一个实施例中，所述几丁聚糖的分子量范围为50-190kD。在其中一个实施例中，在所述配置转染试剂溶液过程中，所述无菌水的pH为5.0-7.0。在其中一个实施例中，在所述配置转染试剂溶液过程中，配置的转染试剂溶液中几丁聚糖的浓度为0.1-1g/ml。在其中一个实施例中，在所述配置转染复合物过程中，是按照几丁聚糖与待转染的含目的DNA的质粒的质量比为5:1的比例配置。在其中一个实施例中，在所述瞬时转染过程中，将所述转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中是按照每106个细胞转染0.1-3μg含目的DNA的质粒的比例添加。在其中一个实施例中，在所述瞬时转染过程中，是于4-37℃、120-300rpm摇晃培养。在其中一个实施例中，在果蝇S2细胞传代培养时，传代细胞的密度为0.1-2×106个细胞/ml。在其中一个实施例中，在所述瞬时转染过程中，当传代培养的细胞密度达到2-50×106个细胞/ml时，进行瞬时转染。上述果蝇S2细胞瞬时转染的方法使用几丁聚糖(chitosan，又名甲壳素、甲壳质)作为转染试剂，转染效率较之多聚赖氨酸(polysine)、脂质体或磷酸钙等转染试剂有明显提高，蛋白产品也显著提高。在分析含目的DNA的质粒与转染试剂形成的转染复合物的大小后发现，几丁聚糖与含目的DNA的质粒形成的转染复合物最小。几丁聚糖作为转染试剂具有价格低廉、操作简单且转染后蛋白产量较高的优点，可适用于果蝇S2细胞的大规模瞬时转染，可在较低成本短时间内(如5天)获得大量重组蛋白。附图说明图1一实施方式的果蝇S2细胞瞬时转染的流程示意图；图2为使用不同转染试剂转染后的EGFP阳性细胞克隆比例；图3为使用不同转染试剂转染后的相对荧光强度；图4为使用不同转染试剂转染后的TNFR-Fc单位产量；图5为使用不同转染试剂得到的转染复合物的大小。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。如图1所示，一实施方式的果蝇S2细胞瞬时转染的方法，包括如下步骤：配置转染试剂溶液：将几丁聚糖溶于pH3-10的无菌水中，配置成浓度为0.1-10g/ml的转染试剂溶液；配置转染复合物：按照几丁聚糖与待转染的含目的DNA的质粒的质量比为1-20:1的比例将转染试剂溶液与待转染的含目的DNA的质粒溶液加入无菌水中，震旦混匀，形成转染复合物；瞬时转染：将转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中，摇晃培养，得到已转染含目的DNA的质粒的果蝇S2细胞。在本实施例中，几丁聚糖的分子量范围为50-300kD，优选50-190kD小分子量范围的几丁聚糖。在配置转染试剂溶液过程中，无菌水优选pH为5.0-7.0的无菌水，更优选为pH6.1的无菌水。配置的转染试剂溶液中几丁聚糖的浓度优选为0.1-1g/ml，更优选为0.2g/ml。在配置转染复合物过程中，优选是按照几丁聚糖与待转染的含目的DNA的质粒的质量比为1-20:1的比例配置。优选，按照5:1的比例配置。在瞬时转染过程中，当传代培养的细胞密度达到2-50×106个细胞/ml时，进行瞬时转染，优选的是达到5×106个细胞/ml时进行瞬时转染。并且在瞬时转染过程中，将转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中是按照每106个细胞转染质量为0.1-3μg含目的DNA的质粒的比例添加，并于4-37℃、120-300rpm摇晃培养。优选的，将转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中是按照每106个细胞转染质量为0.6μg含目的DNA的质粒的比例添加，并于28℃、180rpm摇晃培养。在果蝇S2细胞传代培养时，传代细胞的密度为0.1-2×106个细胞/ml，优选1×106个细胞/ml。上述果蝇S2细胞瞬时转染的方法使用几丁聚糖(chitosan，又名甲壳素、甲壳质)作为转染试剂，转染效率较之多聚赖氨酸(polysine)、脂质体或磷酸钙等转染试剂有明显提高，蛋白产品也显著提高。在分析含目的DNA的质粒与转染试剂形成的转染复合物的大小后发现，几丁聚糖与含目的DNA的质粒形成的转染复合物最小。几丁聚糖作为转染试剂具有价格低廉、操作简单且转染后蛋白产量较高的优点，可适用于果蝇S2细胞的大规模瞬时转染，可在较低成本短时间内(如5天)获得大量重组蛋白。以下结合具体实施例对果蝇S2细胞瞬时转染的方法作进一步详细的说明。果蝇S2细胞来源及传代果蝇S2细胞从TCMetrix本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其特征在于，包括如下步骤：配置转染试剂溶液：将几丁聚糖溶于pH 3‑10无菌水中，配置成浓度为0.1‑10g/ml的转染试剂溶液；配置转染复合物：按照几丁聚糖与待转染的含目的DNA的质粒的质量比为1‑20:1的比例将所述转染试剂溶液与待转染的含目的DNA的质粒溶液加入无菌水中，震荡混匀，形成转染复合物；瞬时转染：将所述转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中，摇晃培养，得到已转染含目的DNA的质粒的果蝇S2细胞。

【技术特征摘要】
1.一种果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其特征在于，包括如下步骤：配置转染试剂溶液：将几丁聚糖溶于pH3-10无菌水中，配置成浓度为0.1-10g/ml的转染试剂溶液；配置转染复合物：按照几丁聚糖与待转染的含目的DNA的质粒的质量比为1-20:1的比例将所述转染试剂溶液与待转染的含目的DNA的质粒溶液加入无菌水中，震荡混匀，形成转染复合物；瞬时转染：将所述转染复合物加入已传代培养的果蝇S2细胞悬液中，摇晃培养，得到已转染含目的DNA的质粒的果蝇S2细胞。2.如权利要求1所述的果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其特征在于，所述几丁聚糖的分子量范围为50-300kD。3.如权利要求2所述的果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其特征在于，所述几丁聚糖的分子量范围为50-190kD。4.如权利要求1所述的果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其特征在于，在所述配置转染试剂溶液过程中，所述无菌水的pH为5.0-7.0。5.如权利要求1所述的果蝇S2细胞瞬时转染的方法，其特征在于，在所述配...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈潇，林兴华，林泽斌，
申请(专利权)人：广州汉腾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44