小鼠肺癌原位荷瘤放疗模型的建立与应用制造技术

本发明专利技术涉及肿瘤模型及其建立与应用领域，具体是一种可用于评估放射治疗效果的小鼠原位荷瘤放疗模型的建立方法及其应用，利用野生型小鼠为载体，利用基因重组技术选将萤火虫荧光素酶基因引入小鼠路易斯肺癌细胞株(LLC)中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠肺部构建而成。本发明专利技术与传统的肿瘤模型方法相比，能模拟肺癌病理生理环境，在肺癌的诊断和治疗中具有重要意义，且该模型具有荧光素酶基因，可在小动物活体成像仪中进行成像，便于实时动态监测肺癌发展过程，观察更加直观方便，可进行活体观察而不损伤动物，结果更加可靠，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
小鼠肺癌原位荷瘤放疗模型的建立与应用
本专利技术涉及肿瘤模型及其建立与应用领域，具体地说，是一种可用于评估放射治疗效果的小鼠原位荷瘤模型的建立及其应用。
技术介绍
肺癌是威胁我国人民健康的头号杀手。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率明显增高，在男性癌瘤病人中，肺癌已居首位，在女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肺癌的病因至今尚不完全明确，但是严重影响了患者的生命健康和生存质量。目前肺癌的主要治疗手段包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及靶向治疗。其中，放射治疗是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)重要的局部治疗手段。近年来，肺癌的放疗和基础研究取得了较大发展，但目前肺癌放疗研究尚欠缺一种能更方便的评估放疗疗效的可靠研究平台，这严重制约了肺癌的基础和临床前研究。肺癌动物模型是肺癌放疗研究的重要手段。目前的荷瘤方式主要分为原位荷瘤与异位荷瘤两种方式，这两种方法都有其各自的优点和局限性。异位荷瘤目前应用比较广泛，主要以皮下注射肿瘤细胞为主，如Keshamouni等人将A549细胞注射入小鼠胸背部皮下，以模拟肺癌的发生(VenkateshwarGKeshamouni,RajuCReddy,DouglasAArenberg,BinjuJoel,VictorJThannickal,GregoryPKalemkerianandTheodoreJStandiford.Peroxisomeproliferator-activatedreceptor-cactivationinhibitstumorprogressioninnon-small-celllungcancer.Oncogene(2004)23,100–108.)。其优点是操作方便、技术简单，然而其局限性也非常的明显，即与真正的小鼠肺癌的发生发展过程存在着较大的差距，无法达到较好的肺癌模拟效果。原位荷瘤模型，又分为原位诱发型和原位移植型。原位诱发型如张朝晖等设计的使BALB/c小鼠长期吸入油烟以诱发肺癌的发生，或者使用基因敲除技术等手段诱发小鼠原位肺癌的发生(张朝晖陈锋谭佑铭让蔚清张丹罗招阳。烹调油烟致Balb/C小鼠肺癌的病理变化。《中国公共卫生》2003年第12期1455-1457页。Macias-PerezI,BorzaC,ChenX,YanX,IbanezR,MernaughG,MatrisianLM,ZentR,PozziA.Lossofintegrinalpha1beta1amelioratesKras-inducedlungcancer.CancerRes.2008Aug1；68(15):6127-35)。该方法能够较好地模拟肺癌的发生发展过程，能够发挥较好地模拟效果，但是存在着建模周期过长、成本较高、不易推广等问题。原位移植型荷瘤是目前较常用的、成本低廉、可操作性较强的建模方法，主要代表包括Zou等人将人肺癌细胞通过细针送入裸鼠气管内成瘤、魏淑珍等人在小鼠呼吸机的支持下通过开胸手术将人肺癌组织直接种植于裸鼠肺叶等方法(ZouY,WuQP,TanseyW,ChowD,HungMC,CharnsangavejC,WallaceS,LiC.Effectivenessofwatersolublepoly(L-glutamicacid)-camptothecinconjugateagainstresistanthumanlungcancerxenograftedinnudemice.IntJOncol.2001Feb；18(2):331-6.魏淑珍，GFP标记的肺癌裸鼠原位模型的建立及埃克替尼体内抑瘤作用的研究，南京大学学位论文，2010)。此类方法也存在着成瘤部位以及大小不稳定、操作难度大、设备要求高等缺陷。另外，因裸鼠存在着天然免疫缺陷，其荷瘤模型并不能很好地反映出在机体正常免疫条件下肿瘤的发生发展过程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠原位荷瘤模型的建立及其应用。本专利技术参考了前人小鼠荷瘤模型的优缺点，设计并实施了可视条件下经肋间隙穿刺的荷瘤方法，操作难度较小，对实验设备的需求不高，具有较高的可操作性。同时，本专利技术选取了正常C57BL/6小鼠制作荷瘤模型，能够较好地反映出天然免疫条件下，肺癌发生发展的过程，模拟效果较好。另外，本专利技术选取的肺癌细胞为荧光素酶转染的小鼠路易斯肺癌细胞株(LLC)，其肿瘤细胞的活力可通过小动物活体成像仪间接检测，便于实验者实时动态监测小鼠肺癌的发展过程。结果显示，该荷瘤方法有成瘤率高、存在较长的实验时间窗、便于实时动态监测肺癌发展过程的优点，具有较高的实用价值。本专利技术的第一方面，提供一种可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，包括以下步骤：利用野生型小鼠为载体，利用基因重组技术将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌LLC细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠肺部构建而成。优选的，所述的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，包括以下步骤：a)将萤火虫荧光素酶Luciferase质粒采用脂质体转染法转入人肺腺癌LLC细胞，流式筛选出稳定表达荧光素酶报告基因的重组细胞株并进行扩大培养；b)将得到的重组人肺腺癌LLC细胞经消化后重悬于DMEM培养基中，在具有正常免疫功能的C57/BL6小鼠右下肺接种该重组人肺腺癌LLC细胞，即得到可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型。优选的，所述的重组人肺腺癌LLC细胞采用注射的方式接种于小鼠肺部。优选的，所述的步骤a中的转染试剂为lip3000转染试剂。优选的，所述的步骤b中的重组人肺腺癌LLC细胞浓度为2×106个/ml。优选的，所述的步骤b中右下肺接种重组人肺腺癌LLC细胞的固定位置为小鼠胸骨剑突右侧10mm处，经过小鼠右下第一或第二肋间隙垂直进针，进针深度5mm。优选的，所述的原位荷瘤模型建立后通过游标卡尺测量和小动物活体成像仪监测肿瘤生长情况。更优选的，具体包括以下步骤：A)将LLC细胞加入DMEM(10％FBS，体积浓度)体外传代培养；B)胰酶消化离心后，将LLC细胞铺入24孔板中，细胞浓度为5×104个/ml；C)12h后使用lip3000将萤火虫荧光素酶质粒转入LLC细胞，萤火虫荧光素酶质粒与lip3000的比例为1:1.5。转染24h后进行换液，并使用荧光显微镜观察转染效果；D)转染72h后将24孔板内细胞铺入96孔板中进行亚克隆筛选，选出高表达萤火虫荧光素酶基因的LLC细胞，并进行扩增；E)使用DMEM培养基重悬吹匀重组的LLC，配制成2×106浓度的细胞悬液后备用；F)在C57BL/6小鼠右下肺注射接种该重组人肺腺癌LLC细胞，注射细胞悬液25μL。进一步的，所述的步骤F注射接种可采用以下步骤：①用10％水合氯醛麻醉C57BL/6小鼠后，使其左侧卧于手术台上并固定；②如图1A所示，消毒后，于小鼠胸骨剑突右侧10mm处，切开皮肤并剥离右侧胸壁前肌层，暴露小鼠胸腔壁层及肋间隙，可见其活动的右下肺叶；③吹匀重组的LLC细胞悬液，用微量注本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：利用野生型小鼠为载体，利用基因重组技术将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌LLC细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠肺部构建而成。

【技术特征摘要】
1.一种可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：利用野生型小鼠为载体，利用基因重组技术将萤火虫荧光素酶基因引入人肺腺癌LLC细胞株中，通过亚克隆筛选获得稳定表达荧光素酶的肿瘤克隆细胞株，然后采用重组的LLC细胞接种于小鼠肺部构建而成。2.根据权利要求1所述的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：a)将萤火虫荧光素酶Luciferase质粒采用脂质体转染法转入人肺腺癌LLC细胞，流式筛选出稳定表达荧光素酶报告基因的重组细胞株并进行扩大培养；b)将得到的重组人肺腺癌LLC细胞经消化后重悬于DMEM培养基中，在具有正常免疫功能的C57/BL6小鼠右下肺接种该重组人肺腺癌LLC细胞，即得到可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型。3.根据权利要求1或2所述的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模型的建立方法，其特征在于，所述的重组人肺腺癌LLC细胞采用注射的方式接种于小鼠肺部。4.根据权利要求2所述的可用于评估放射治疗效果的具有正常免疫功能小鼠的原位荷瘤模...

【专利技术属性】
技术研发人员：高福，杨彦勇，雷霄，蔡建明，崔建国，李百龙，陈媛媛，许洋，刘哲，郭佳铭，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31