一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种双荧光报告重组质粒载体，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列。构建方法为：首先用PCR方法扩增绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因；然后将扩增的绿色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G‑BI启动子的3’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G‑GFP，并进行测序分析，将扩增的红色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G‑GFP启动子的5’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G‑GFP‑mCherry，并进行测序分析，用PCR方法扩增靶基因的3’非翻译区序列插入到质粒载体pTRE3G‑GFP‑mCherry的mCherry 3’方向上，将验证正确后的重组质粒载体命名为pTRE3G‑GFP‑mCherry‑3UTR。该双荧光报告重组质粒载体可应用于验证miRNA与其靶基因是否在序列上具有相互结合的关系。

A double fluorescence report recombinant plasmid vector and its construction method and Application

The invention discloses a double fluorescent reporter recombinant plasmid vector, which contains the encoded green fluorescent protein gene sequence, the red fluorescent protein gene sequence and the 3 'untranslated region sequence of the miRNA specific target gene. The construction method is as follows: first amplified by PCR green fluorescent protein and red fluorescent protein gene; 3 'direction and the green fluorescent protein gene fragment inserted into the plasmid pTRE3G BI promoter. The recombinant plasmid pTRE3G GFP, and sequencing analysis, will be inserted into the red fluorescent protein gene fragment amplification to the plasmid pTRE3G GFP promoter 5' direction, the recombinant plasmid pTRE3G GFP mCherry, sequenced and analyzed. The target gene 3 'UTR sequences inserted into the plasmid pTRE3G GFP mCherry mCherry 3' direction was amplified by PCR, the recombinant plasmid after proving the correctness of vector named pTRE3G GFP mCherry 3UTR. The double fluorescence report recombinant plasmid vector can be used to verify whether the miRNA and its target genes are binding to each other in the sequence.

【技术实现步骤摘要】
一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和用于验证miRNA是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。
技术介绍
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。从本世纪初，科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个miRNA中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNA表达模式具有分化的位相性和时序性，由于miRNA存在的广泛性和多样性，提示miRNA可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对miRNA的研究还处于初级阶段，据推测miRNA在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：miRNA可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。然而，大多数miRNA的靶基因及功能仍旧未知。因此，明确miRNA的靶基因并验证其参与调控基因表达的分子基础具有重要意义。采用荧光表达系统定量基因表达时，通常使用第二个报告基因作为内参来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因比如氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(β-Gal)或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)不够便利，因为各自的测试处理要求、检测特点存在差异。近年使用较多的萤火虫荧光素酶避免了上述缺点，但是由于荧光素酶底物价格昂贵，需使用特殊仪器检测荧光素酶表达等因素限制了其使用范围。
技术实现思路
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本专利技术的一个目的在于，提供一种含有双报告基因的重组质粒载体及其构建方法，本专利技术的另一个目的在于，将构建的含有双报告基因的重组质粒载体用于验证miRNA及其靶基因之间的关系，以便实现miRNA与靶序列的快速检测。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列。根据本专利技术，所述编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因在双向的转录响应原件启动子(Transcriptionalresponseelement，TRE)的控制下表达。所述编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列以及miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列被放置在两个表达读码框内，所述编码的绿色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、绿色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第一polyA加尾信号；所述编码的红色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、红色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第二polyA加尾信号。进一步地，所述的双向转录响应原件启动子的激活受强力霉素的调控。上述双荧光报告重组质粒载体的构建方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：(1)用PCR方法扩增绿色荧光蛋白基因；(2)将步骤(1)扩增的绿色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G-BI启动子的3’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G-GFP，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；(3)用PCR方法扩增红色荧光蛋白基因；(4)将步骤(3)扩增的红色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体pTRE3G-GFP启动子的5’方向上，获得重组质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；(5)用PCR方法扩增miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列插入到质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry的mCherry3’方向上，将验证正确后的重组质粒载体命名为pTRE3G-GFP-mCherry-3UTR。根据申请人的实验表明，上述双荧光报告重组质粒载体可以用于验证miRNA是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。将重组质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry-3UTR转染人胚肾细胞HEK293，同时转染合成的miRNA于HEK293细胞中。将所述转染细胞在37℃培养24小时后于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下可清楚地显示出编码绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达水平。由于编码绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白均由同一个双向转录响应原件启动子(TRE)所控制，因此在对照组中编码绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达水平是相同的。而在加入测试miRNA的实验组，由于miRNA会结合红色荧光蛋白3’非翻译区的靶序列，阻遏了红色荧光蛋白的翻译，因此在荧光显微镜下将观察到红色荧光蛋白的表达水平远低于绿色荧光蛋白，从而验证了miRNA的靶序列的特异性。通过实验证实，本专利技术构建的双荧光报告重组质粒载体可以用于验证任意的miRNA与其靶序列之间的关系。本专利技术构建的双荧光报告重组质粒载体，具有以下有益效果：1、由于双荧光报告重组质粒载体含有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，当用转染方法将重组质粒载体和任意miRNA导入人胚肾细胞HEK293后，如果miRNA特异性的靶向3’非翻译区的序列，将会降低红色荧光蛋白的表达；如果转染的miRNA不靶向所构建的3’非翻译区序列，红色荧光蛋白的表达水平将不会降低。同时编码绿色荧光蛋白作为内参，其表达水平与miRNA是否靶向3’非翻译区序列无关。因此该重组质粒载体可以方便快捷的在荧光显微镜下检测miRNA与其预测的靶序列之间的关系。2、由于双荧光报告重组质粒载体中，编码的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的基因均在双向转录响应原件启动子的控制下表达，且编码序列被放置在两个表达读码框内，因而能独立表达各自的蛋白产物，同时编码的红色荧光蛋白的表达框在不受miRNA影响的情况下，其表达水平与编码的绿色荧光蛋白的表达水平是高度一致的。同时编码的红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的表达框构建在同一个重组质粒载体内，避免了由于转染效率不同而引起的误差。3、由于双荧光报告重组质粒载体使用了荧光蛋白作为报告基因，可以直接在荧光显微镜下进行观察。与荧光素酶报告系统相比，不需要加入底物参与反应，同时不需要其它定制的仪器来检测荧光素酶的表达，因而该重组质粒检测系统降低了对该类实验的仪器要求以及实验成本。4、由于双荧光报告重组质粒载体使用了双向转录响应原件启动子，该启动子的激活需要四环素诱导表达系统及强力霉素的参与，因此对miRNA及其靶序列之间的互作关系的检测可以根据实验时间的需要而开展，增强了实验的可操控性。同时，强力霉素由于低廉的价格已被广泛的使用，而且强力霉素的安全性也已被大量的实验所验证，降低了对实验的影响。附图说明图1是本专利技术重组质粒载体pTRE3G-GFP-mCherry-3UTR的结构示意图；图2是原始质粒载体pTRE3G-BI的结构示意图；图3是绿色荧光蛋白(GFP)的PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列。

【技术特征摘要】
2017.06.20 CN 20171047088021.一种双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列。2.如权利要求1所述的双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，所述编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因在双向的转录响应原件启动子(Transcriptionalresponseelement，TRE)的控制下表达。3.如权利要求1或2所述的双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，所述编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列以及miRNA特异靶基因的3’非翻译区序列被放置在两个表达读码框内，所述编码的绿色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、绿色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第一polyA加尾信号；所述编码的红色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、红色荧光蛋白、和miRNA特异靶基因3’非翻译区序列下游的第二polyA加尾信号。4.如权利要求2所述的双荧光报告重组质粒载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李星，张媛，赵莉，韩娟娟，张菲，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61