含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种含鳞翅目病毒增强子的表达载体在双翅目昆虫细胞中的应用。该表达载体具有调控单元及位于所述调控单元下游的编码单元，所述调控单元含有hr‑x增强子或其功能片段或序列变体、AcIE‑y启动子或其功能片段或序列变体、以及OpIE‑z启动子或其功能片段或序列变体。本发明专利技术通过将含鳞翅目病毒增强子的表达载体应用在双翅目昆虫细胞中，可以显著提高导入双翅目昆虫细胞中的编码单元的表达水平，使各种异源基因或重组基因得到大量表达。

Application of recombinant expression vector containing Lepidoptera virus enhancer in Diptera Insect Cells

The present invention relates to the application of an expression vector containing Lepidoptera virus enhancer in the Diptera Insect cells. The expression vector with control unit and located in the downstream of the encoding unit control unit, the control unit containing HR x enhancer or its functional fragment or sequence variants, AcIE y promoter or its functional fragment or sequence variants, and OpIE Z promoter or its functional fragment or sequence variants. By applying the expression vectors containing Lepidoptera enhancer to dipteran insect cells, the expression level of coding units in dipteran insect cells can be significantly improved, and various heterologous genes or recombinant genes can be expressed in large quantities.

【技术实现步骤摘要】
含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用。
技术介绍
昆虫细胞系是各种研究应用以及作为疫苗的病毒类颗粒(VLP)的重组蛋白异源表达的重要宿主(Cherezov等，2007；Imasaki等人，2011；Rasmussen等人，2007；White等人，2012；Metz和Pijlman，2011；Shrestha等人，2007；Treanor等人，2011；Treanor等人，2011年)。传统的在昆虫细胞系的研究应用过程中，主要是利用杆状病毒重组表达载体系统(BEVS)来感染源自鳞翅目的细胞系(Berger等人，2004；Jarvis，2009；Kost等人，2005；Summers，2006)。尽管BEVS的运用非常成功，其还是存在几个缺点，如杆状病毒载体的生成将可能需要长达3个星期(Jarvis，2014年)，而因为病毒引起的细胞裂解，蛋白生产阶段的持续时间被限制在约3-4天以内；分泌蛋白和细胞表面蛋白的通常产量往往小于10μg/mL，而细胞内蛋白质的产量已经有报道达到了100μg/mL(Harrison和Jarvis，2007；Jarvis，2009)。可以通过稳定转染昆虫细胞系来替代使用BEVS瞬时生产蛋白质的方法，但是，这种方法不仅费时，而且蛋白产量通常很低(Harrison和Jarvis，2007；Drugmand等人，2012)。通常使用BEVS来构建重组表达载体是将目的基因人工连接于杆状病毒的晚期(late)和/或非常晚期(verylate)启动子之后，利用其强力启动子，以期能表达较大量的目标蛋白。但该方法存在非常明显的缺陷，即通常在晚期(late)或非常晚期(verylate)启动子开始表达之后，宿主细胞将在两、三天内快速死亡，无法达到长期表达的目的。S2(DrosophilaSchneider2)细胞是一种果蝇细胞，是一种属于双翅目果蝇科果蝇属的昆虫细胞。由于种属隔离，应用于不同种属的重组重组表达载体通常无法通用，即在鳞翅目昆虫细胞中高效表达的重组表达载体，无法在双翅目昆虫细胞中有效表达。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用。一种含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，所述重组表达载体具有调控单元及位于所述调控单元下游的编码单元，所述调控单元含有hr-x增强子或其功能片段或序列变体、AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体、以及OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体，其中，x为3或5，y为1，z为1或2。在其中一个实施例中，所述OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体位于所述AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体的下游。在其中一个实施例中，所述hr-x增强子为AcMNPV中的hr-5增强子、AcMNPV中的hr-3增强子或Bombyxmori中的hr-3增强子。在其中一个实施例中，所述hr-x增强子为AcMNPV中的hr-5增强子，且所述hr-5增强子的序列为SEQIDNO.1中第1位-第482位所示序列。在其中一个实施例中，所述AcIE-y启动子为AcMNPV中的AcIE-1启动子，且所述AcIE-1启动子的序列为SEQIDNO.1中第487位-第1033位所示序列。在其中一个实施例中，所述OpIE-z启动子为OpMNPV中的OpIE-1启动子或OpIE-2启动子，且所述OpIE-1启动子的序列为SEQIDNO.2中第1位-第289位所示序列，所述OpIE-2启动子的序列为SEQIDNO.3中第3位-第551位所示序列。在其中一个实施例中，所述OpIE-z启动子为OpMNPV中的OpIE-2启动子。在其中一个实施例中，所述双翅目昆虫细胞为果蝇S2细胞。一种双翅目昆虫细胞，所述双翅目昆虫细胞具有含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体，所述含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体是上述含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用中所使用的所述含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体。一种目的蛋白的制备方法，包括如下步骤：将含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体转染双翅目昆虫细胞，所述含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体为上述含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用中所使用的所述含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体；培养所述双翅目昆虫细胞，使目的蛋白表达，收集表达的目的蛋白，即得。本专利技术通过将含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体应用在双翅目昆虫细胞中，可以显著提高导入双翅目昆虫细胞中的编码单元的表达水平，使各种异源基因或重组基因得到大量表达。附图说明图1为pIEx-X载体的结构示意图；图2为pOPIE1载体的结构示意图；图3为pOPIE2载体的结构示意图；图4为phrOPIE1载体的结构示意图；图5为phrOPIE2载体的结构示意图；图6为在瞬时表达过程中，转染不同重组表达载体后的EGFP阳性细胞比率；图7为在瞬时表达过程中，转染不同重组表达载体后EGFP的相对荧光单位；图8为在稳定表达中，转染不同重组表达载体后EGFP的相对荧光单位；图9为在瞬时表达过程中，转染不同重组表达载体后TNFR-Fc单位产量；图10为在瞬时表达过程中，在不同培养体系中，转染不同重组表达载体后的TNFR-Fc单位产量随时间的变化曲线；图11为在稳定表达中，转染不同重组表达载体后的TNFR-Fc单位产量随时间的变化曲线。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。本专利技术提供了一种含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用。重组表达载体具有调控单元及位于调控单元下游的编码单元。调控单元含有hr-x增强子或其功能片段或序列变体、AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体、以及OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体。编码单元含有编码目的蛋白的基因序列，如各种重组或异源基因。本专利技术的hr-x增强子或其功能片段或序列变体、AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体与OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体依次连接，且OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体位于AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体的下游。hr-x增强子或其功能片段或序列变体可以位于AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体的上游，或者位于OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体的下游。在本实施例中，hr-x增强子为AcMNPV中的hr-5增强子、AcMNPV中的hr-3增强子或Bombyxmori中的hr-3增强子；hr-x增强子优选为AcMNPV中的hr-5增强子，hr-5增强子的序列为SEQIDNO.1中第1位-第482位所示序列。AcIE-y启动子为AcMNPV中的AcIE-1启动子，AcIE-1启动子的序列为SEQIDNO.1中第487位-第1033位所示序列。OpIE-z启动子为OpMNPV本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，其特征在于，所述重组表达载体具有调控单元及位于所述调控单元下游的编码单元，所述调控单元含有hr‑x增强子或其功能片段或序列变体、AcIE‑y启动子或其功能片段或序列变体、以及OpIE‑z启动子或其功能片段或序列变体，其中，x为3或5，y为1，z为1或2。

【技术特征摘要】
1.一种含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，其特征在于，所述重组表达载体具有调控单元及位于所述调控单元下游的编码单元，所述调控单元含有hr-x增强子或其功能片段或序列变体、AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体、以及OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体，其中，x为3或5，y为1，z为1或2。2.如权利要求1所述的含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，其特征在于，所述OpIE-z启动子或其功能片段或序列变体位于所述AcIE-y启动子或其功能片段或序列变体的下游。3.如权利要求1所述的含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，其特征在于，所述hr-x增强子为AcMNPV中的hr-5增强子、AcMNPV中的hr-3增强子或Bombyxmori中的hr-3增强子。4.如权利要求3所述的含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，其特征在于，所述hr-x增强子为AcMNPV中的hr-5增强子，且所述hr-5增强子的序列为SEQIDNO.1中第1位-第482位所示序列。5.如权利要求1所述的含鳞翅目病毒增强子的重组表达载体在双翅目昆虫细胞中表达蛋白的应用，其特征在于，所述AcIE-y启动子为AcMNPV中的AcIE-1启动子，且所述AcIE-1启动子的序列为SEQIDNO.1中第487位-第1033位所示序列。6.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈潇，戴维哈克，
申请(专利权)人：广州汉腾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44