一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法技术

本发明专利技术利用CRISPER‑Cas9系统介导完成山羊Tβ4基因定点敲入，其是依据山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPER‑Cas9系统的gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体。然后将优化后的CRISPER‑Cas9载体和构建的gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转入山羊骨骼肌卫星细胞中，获得Tβ4基因定点敲入的细胞。本发明专利技术所构建的基于CRISPER‑Cas9系统的打靶载体为山羊Tβ4基因的定点敲入提供了一种简单快捷安全的途径。该方法在细胞系筛选过程中没有涉及任何筛选标记基因，从而大大提高了转基因动物的安全性，对山羊的遗传育种以及基因功能的研究具有重要价值。

A method of CRISPR/Cas9 mediated T beta 4 gene of goat based on fixed-point type

The present invention guide complete goat T beta 4 gene typing by CRISPER fixed-point Cas9 system, it is the basis of CCR5 gene sequence of goat CRISPER, constructing Cas9 system based on gRNA expression vector and T beta 4 homologous recombinant vector. Then the CRISPER Cas9 vector optimized and constructed gRNA expression vector and T beta 4 homologous recombinant vector into common goat skeletal muscle satellite cells, T beta 4 gene knock in fixed cells. The invention constructed targeting vector CRISPER based on Cas9 system for goat T beta provides a simple and quick way to safety in 4 designated genes. This method does not involve any screening marker genes in cell line screening process, which greatly improves the safety of transgenic animals, and is of great value for the study of goat breeding and gene function.

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法
本专利技术涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及CRISPER-Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法。
技术介绍
CRISPR-Cas9作为一项基因定点修饰技术，近些年来发展迅速。该技术基于规律性短重复回文序列簇（Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR）和Cas9核酸酶（CRISPRassociatedsystem9，Cas9），是存在于细菌和古生菌的获得性免疫系统，通过其转录产物crRNA(CRISPRRNA)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated,Cas)，尤其是Cas9蛋白，可以有效的帮助菌体抵抗外源DNA的侵染。基于该原理CRISPR-Cas9系统被改造成第三代基因编辑技术，该技术由一种短小RNA引导对DNA进行修饰，将DNA双链切开造成缺口，然后通过细胞的自我修复或是在外源基因存在下的同源重组修复，来实现基因的定点突变或定点敲入。该技术目前已经成功应用于多项研究，和其他同类技术相比，该技术表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPER‑Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法，其特征在于，其是根据山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPER‑Cas9系统的gRNA表达载体和Tβ4同源重组载体，然后将优化后的CRISPER‑Cas9载体和上述构建的gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转入山羊骨骼肌卫星细胞中，获得Tβ4基因定点敲入的细胞。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPER-Cas9系统介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法，其特征在于，其是根据山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体和Tβ4同源重组载体，然后将优化后的CRISPER-Cas9载体和上述构建的gRNA表达载体及Tβ4同源重组载体共同转入山羊骨骼肌卫星细胞中，获得Tβ4基因定点敲入的细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，靶位点在安全位点CCR5基因的第2外显子上。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶序列为5′-TCGTGGGGGAGAAGTTCCGA-3′。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述山羊...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓聪，梁浩，郝斐，潘伟，王志钢，刘东军，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15