与心肌梗死相关的突变及其应用制造技术

本发明专利技术涉及与心肌梗死相关的突变及其应用，具体涉及是与凝血因子缺乏症合并急性下壁心肌梗死相关的突变及其应用。发明专利技术基于临床研究，收集凝血因子Ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死患者外周血进行高通量测序分析，通过查找患者基因突变，发现他们的凝血因子Ⅻ基因外显子存在1个突变G774A，该突变与FⅫ缺乏症合并急性下壁心肌梗死具有很好的相关性，为后续临床诊断与治疗奠定基础。

Mutations associated with myocardial infarction and their application

The invention relates to the mutation related to myocardial infarction and its application, especially to the mutation associated with coagulation factor deficiency combined with acute inferior myocardial infarction and its application. The invention is based on clinical research, collection of factor XII deficiency combined with high-throughput sequencing analysis in patients with acute inferior myocardial infarction in peripheral blood, by looking for patients with mutations, found their factor gene exon 1 G774A mutation, the mutation and F XII deficiency complicated with acute inferior myocardial infarction with good correlation, which lays the foundation for further clinical diagnosis and treatment.

【技术实现步骤摘要】
与心肌梗死相关的突变及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及与心肌梗死相关的突变及其在诊治疾病中的应用，尤其是与凝血因子缺乏症合并急性下壁心肌梗死相关的突变及其应用。
技术介绍
心血管疾病日益成为人类死亡的主要因素，而在心血管疾病中，心肌梗死是患者住院率最高的疾病之一。心肌梗死是指心肌的缺血性坏死，为在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死。急性心肌梗死具有起病急，致死致残率高等特点，已成为威胁人类健康的重要原因。近年来，寻找具有高灵敏性和特异性的标记分子，用于及时诊断、预防以及控制急性心肌梗死发生发展，己成为急性心肌梗死治疗及预后评估的研究热点。凝血因子是血浆与组织中直接参与凝血的物质的统称。其中已按国际命名法，用罗马数字按发现的次序编号的凝固因子有12种：凝血因子I，II，III，IV，V，VII，VIII，IX，X，XI，Ⅻ，ⅫI。此外，还有前激肽释放酶、激肽释放酶，以及来自血小板的磷脂等。凝血因子Ⅻ(FⅫ)又称接触因子、表面因子或HAGEMAN因子，其化学本质是糖蛋白，在肝脏中合成，主要功能为丝氨酸蛋白酶激活因子IX及PK。FⅫ缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，部分患者可表现为显性遗传，最早由Ratnoff于1955年报道，近年来有学者相继报道了FⅫ缺陷的FⅫ基因突变位点，临床上仅表现为活化部分凝血活酶时间(APTT)延长，而无明显的出血表现，多为术前、有创操作前或查体偶然发现，以凝血因Ⅻ活性和/或凝血因Ⅻ抗原水平降低为特征。现有研究认为凝血因子Ⅻ缺乏是预防血栓的保护性因素，认为凝血因子Ⅻ在止血过程中并不必需，但可促成病理性血栓，认为凝血因子Ⅻ缺乏是预防血栓的保护性因素，甚至提出在卒中及其他血栓栓塞疾病中可考虑将凝血因子Ⅻ作为治疗靶点；还有研究认为凝血因子Ⅻ缺乏与血栓无关。本专利技术基于临床研究，收集凝血因子Ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死病例3例，通过高通量测序分析，通过查找患者基因突变，发现他们的凝血因子Ⅻ基因第8外显子存在1个stopgain突变G774A(p:W258X)，导致编码的第258位氨基酸由色氨酸变为stopgain，显示该突变具有致病性，为后续临床应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种分离的突变体核苷酸，该突变体核苷酸的基因序列如SEQIDNO：1所示。上述分离的突变体核苷酸为凝血因子Ⅻ基因外显子上的突变G774A。本专利技术的目的在于提供一种分离的突变体多肽，该突变体多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术的技术方案为：通过高通量测序分析，通过查找患者基因突变，发现他们的凝血因子Ⅻ基因外显子存在1个stopgain突变G774A(p:W258X)，导致编码的第258位氨基酸由色氨酸变为stopgain(终止子)，显示该突变具有致病性。基于此，可以采用检测该突变的方法，作为检测疾病的分子辅助判断依据。一种检测生物样品是否存在凝血因子Ⅻ基因G774A突变的方法，包括以下步骤：(1)利用凝血因子Ⅻ基因的第8外显子特异性引物对生物样品进行PCR扩增，针对所得扩增产物构建核苷酸测序文库，测序；(2)检测生物样品中核苷酸是否存在G774A突变或氨基酸是否存在W258X突变。一种心肌梗死检测试剂盒，所述试剂盒检测凝血因子Ⅻ基因G774A突变情况。含凝血因子Ⅻ基因G774A突变的生物样品具有较高的患病风险。优选的，心肌梗死为凝血因子Ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死。本专利技术的目的在于提供检测上述突变体核苷酸、突变体多肽或检测试剂盒在制备心肌梗死诊断试剂中的应用。优选的，在制备检测凝血因子Ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死试剂中的应用。进一步，诊断试剂的检测方法包括采用PCR-SSCP法、异源双链分析法、变性梯度凝胶电泳法、化学切割错配法、等位基因特异性寡核苷酸分析法、DNA芯片技术、连接酶链反应、等位基因特异性扩增法、直接测序法等方法。PCR-SSCP法是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于基因突变的检测。异源双链分析法(HA)，该方法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。变性梯度凝胶电泳法(DGGE)，DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程而被分离。化学切割错配法(CCM)，CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混和变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C、T能被切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变，该法检出率很高。等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)，ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表明样品中存在与该ASO探针相应的点突变。DNA芯片技术，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高。连接酶链反应(LCR)，LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5’-磷酸与另一相邻链3’-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5’-磷酸与3’-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。等位基因特异性扩增法(ASA)，通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸。直接测序法(DS)，DS法测序的模板主主要来源于PCR，应用不对称PCR和基因组扩增转录同步测序法(GAWTS)等，使单链产物大大增加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的突变体核苷酸，该突变体核苷酸的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离的突变体核苷酸，该突变体核苷酸的基因序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的突变体核苷酸编码的突变体多肽，该突变体多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。3.一种心肌梗死检测试剂盒，其特征在于，试剂盒用以检测权利要求1突变核苷酸或权利要求2突变体多肽。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，心肌梗死为凝血因子Ⅻ缺乏症合并急性下壁心肌梗死。5.权利要求1所述的突变体核苷酸在制备心肌梗死诊断试剂中的应用。6.权利要求2所述突变体多肽制备心肌梗死诊断试剂中的应用。7.权利要求3或4所述检测试剂盒在制备心肌梗死诊断试剂中的应用。8.根据权利要求5-7任意一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖冰，杨秀春，鲁静朝，刘凡，
申请(专利权)人：河北医科大学第二医院，
类型：发明
国别省市：河北,13