刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法技术

本发明专利技术公开了一种刺槐的Subtilisin1基因，通过对刺槐总RNA进行提取和反转录后合成cDNA，并采用Race技术得到了刺槐Subtilisin1基因序列(SEQ ID NO：1)，对该序列进行全长扩增得到了刺槐Subtilisin1基因。本发明专利技术得到的刺槐Subtilisin1基因主要在刺槐的花和叶中表达，在刺槐的根和茎、荚中表达量相对较低。刺槐Subtilisin1基因在老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量，表明该基因是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老；该基因的克隆为刺槐及其他林木分子育种的研究垫定理论基础。

Locust like Subtilisin Protease Gene, its coding protein, its clone primer and its cloning method

The present invention discloses a kind of Subtilisin1 gene of Robinia pseudoacacia, by extraction and reverse transcription after synthesis of cDNA on locust total RNA, and obtained the locust Subtilisin1 gene sequence using Race Technology (SEQ ID NO:1), the full-length sequences were amplified Subtilisin1 gene of Robinia pseudoacacia. The Subtilisin1 gene of Robinia pseudoacacia was mainly expressed in the flowers and leaves of Robinia pseudoacacia, and its expression was relatively low in roots, stems and pods of Robinia pseudoacacia. The expression of Subtilisin1 gene in locust aging tissues was higher than the expression in young tissues, indicating that the gene is a protective mechanism of plant itself, is used to delay senescence; cloning of the gene for the locust and other tree molecular breeding research laid theoretical foundation.

【技术实现步骤摘要】
刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因、其编码蛋白、其克隆引物及其克隆方法
本专利技术涉及一种遗传工程的RNA的分离、制备、纯化和应用，特别涉及一种编码植物蛋白质的基因的分离、制备纯化和应用，属于分子生物学的遗传工程领域。
技术介绍
枯草杆菌蛋白酶是一类催化活性依赖于丝氨酸残基的蛋白水解酶，该酶参与生物发育的很多过程：种子萌发、胁迫相应、果实成熟、器官衰老、果实成熟、细胞凋亡及细胞程序性死亡等过程。类枯草杆菌蛋白酶类有200多个不同的家族成员构成。植物中已有大量关于类枯草杆菌蛋白酶基因的研究报道，包括大豆、番茄、拟南芥、木麻黄、柑橘等。在植物中，拟南芥的类枯草杆菌蛋白酶基因研究的较为清楚。在拟南芥基因组中总共有56个Subtilisin家族成员，SUT1在拟南芥气孔前体细胞中强烈表达，影响叶片的分布和密度。Subtilisin家族在拟南芥中的发育调控、细胞周转和信号传导三个方面发挥功能。介导细胞与其他细胞之间的信号传导，促进拟南芥胚发育时期的表皮形成。燕麦中的Subtilisin-like基因参与细胞程序化死亡过程中的蛋白水解级联反应。刺槐(Robiniapseudoacacia)属于雌雄同花植物，原生于北美洲，后被广泛引种到欧洲、亚洲等地。刺槐叶片含有大量粗蛋白，可作饲料；刺槐木质坚硬且具有发达的根系；刺槐根部有根瘤，有提高地力之效；刺槐具有很强的抗旱能力，能够适应石质山地的干旱环境。槐的花属于蝶形花，开花时香气四溢，并且可供食用。综上所述，刺槐具有很好的生态和经济价值。目前关于刺槐抗性的分子生物学研究基础还比较薄弱。类枯草杆菌蛋白酶是植物受胁迫后诱导表达的一类蛋白质，他在植物受到抗旱、抗寒、抗盐、机械损伤等胁迫响应途径中具有重要作用[13]。转基因研究也证明Subtilisin1基因在提高植物抗逆性中具有重要的作用。本文以刺槐Subtilisin1基因为研究对象，以刺槐的花为材料，克隆刺槐Subtilisin1基因并进行了生物信息学分析、表达模式分析，为将来刺槐抗性育种研究和分子育种工作提供理论基础。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种刺槐类枯草杆菌蛋白酶基因(即刺槐Subtilisin1基因)、刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白、刺槐Subtilisin1基因克隆的引物以及克隆刺槐Subtilisin1基因的方法，本专利技术的刺槐Subtilisin1基因同源基因能在刺槐生长的各个阶段表达，而且能在刺槐的老化组织中的表达量高于幼嫩组织中的表达量，推测这是植物自身的一种防护机制，用来延缓组织衰老，同时为刺槐抗性育种研究和分子育种工作提供理论基础和科学依据，具有重要意义。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。本专利技术首先以刺槐的花为原料，提取总RNA，接着进行RNA的反转录，合成cDNA第一链；接着根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列(即EST序列片段)设计PCR扩增引物，以合成的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，得到刺槐Subtilisin1基因的序列中间片段(即EST系列片段)；然后再根据获得的保守序列中间片段分别设计5′-race扩增引物进行5′-端扩增；设计3′-race扩增引物进行3′-端扩增，得到刺槐Subtilisin1基因。其中，进行PCR扩增的引物具体如下：正向引物(SBTF)：5′-TGTTGTGAAGAAAGCCG-3′；反向引物(SBTR)：5′-GTGAGGGCAAGCCATTGA-3′。特别是，5′-race扩增引物包括一对5′-race锚定引物和一对扩增5′端引物。尤其是，所述5′-race锚定引物具体如下：AAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′；AUAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′。尤其是，所述扩增5′端引物具体如下：5′race1R：5′-GAAGAAGATGAGCATCTC-3′；5′race2R：5′-TTCCGTTAGCCAGAATCA-3′。特别是，3′-race扩增引物包括一对3′-race锚定引物和扩增3′端引物。尤其是，所述3′-race锚定引物具体如下：B26：5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′；B25：5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′。尤其是，所述扩增3′端引物具体如下：3′race1F：5′-TTGGACCGACGCTGTGGGT-3′；3′race2F：5′-ATTCTAGAAGAACCGAAT-3′。特别是，所述刺槐Subtilisin1基因片段序列即是刺槐Subtilisin1基因的EST序列片段。尤其是，根据所述刺槐Subtilisin1基因的EST序列片段，利用primer5软件设计所述PCR扩增引物。本专利技术另一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白组，其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。本专利技术又一方面提供一种刺槐Subtilisin1基因克隆的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、和SEQIDNo.12。其中，所述SEQIDNo.3的核苷酸序列为5′-TGTTGTGAAGAAAGCCG-3′；所述SEQIDNo.4的核苷酸序列为5′-GTGAGGGCAAGCCATTGA-3′；所述SEQIDNo.5的核苷酸序列为5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGGGGG-3′；所述SEQIDNo.6的核苷酸序列为5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′；所述SEQIDNo.7的核苷酸序列为5′-GAAGAAGATGAGCATCTC-3′；所述SEQIDNo.8的核苷酸序列为5′-TTCCGTTAGCCAGAATCA-3′；所述SEQIDNo.9的核苷酸序列为5′-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′；所述SEQIDNo.10的核苷酸序列为5′-GACTCGAGTCGACATCGA-3′；所述SEQIDNo.11的核苷酸序列为5′-TTGGACCGACGCTGTGGGT-3′；所述SEQIDNo.12的核苷酸序列为5′-ATTCTAGAAGAACCGAAT-3′。本专利技术提供一种刺槐Subtilisin1基因的克隆方法，包括如下顺序进行的步骤：1)提取刺槐花中的总RNA，纯化后进行反转录，合成cDNA第一链；2)以刺槐cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段；3)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行5′-race扩增，获得5′-端扩增产物；4)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行3′-race扩增，获得3′端扩增产物；5)扩增产物进行拼接，即得。其中，步骤2)中所述PCR扩增包括如下步骤：2-1)根据刺槐Subtilisin1基因的片段序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种刺槐Subtilisin1基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种刺槐Subtilisin1基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。2.一种刺槐Subtilisin1基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQIDNO：2所示。3.一种刺槐Subtilisin1基因克隆的引物，其特征是所述引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQIDNo.11、和SEQIDNo.12。4.一种刺槐Subtilisin1基因的克隆方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：1)提取刺槐花中的总RNA，纯化后进行反转录，合成cDNA第一链；2)以刺槐cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段；3)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行5′-race扩增，获得5′-端扩增产物；4)根据刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段，进行3′-race扩增，获得3′端扩增产物；5)扩增产物进行拼接，即得该基因全长。5.如权利要求4所述的克隆方法，其特征是，步骤2)中所述PCR扩增包括如下步骤：2-1)根据刺槐Subtilisin1基因的片段序列设计一对中间片段扩增引物；2-2)以步骤1)获得的刺槐cDNA第一链为模板，进行PCR扩增；2-3)扩增产物进行拼接，获得刺槐Subtilisin1基因保守序列中间片段。6.如权利要求4所述的克隆方法，其特征是，步骤2-1)中所述的引物分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。7.如权利要求4或5所述的克隆方法，其特征是，步骤3)中所述5′-race扩增包括如下步骤：3-1)根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李云，王金星，孙宇涵，胡瑞阳，袁存权，文彦忠，邓永平，苏立琢，闫继锋，王连洲，纪清巨，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11