本发明专利技术属于生物工程中的DNA重组技术领域，涉及本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体是基于BACE1选择性剪接机制的基因重组出一种对APP病理切割和Aβ形成促进作用的52KD亚型的BACE1，通过ELISA实验检测52KD亚型BACE1对Aβ1‑40和Aβ1‑42的生成具有促进作用，并通过行为学实验验证其对AD鼠记忆的损伤作用，最后通过病理学实验验证其对脑内Aβ形成的促进作用。52KD亚型BACE1为AD的诊断、分子靶点的深入研究及药物研发提供依据和线索。
The function development and application of the BACE1 subtype promoting the accumulation of A beta in the brain
The invention belongs to the technical field of recombinant DNA in biological engineering, relates to the invention belongs to the technical field of biological engineering, in particular gene recombinant BACE1 alternative splicing mechanism of a kind of APP pathological cutting and A beta to promote the formation of the role of the 52KD subtype of BACE1 based on the ELISA assay of 52KD subtype BACE1 has a promoting effect on A beta 1 and beta 1 40 A 42 generation, and verify the injury on rat AD memory through behavioral experiments through pathology experiment verify its promoting effect on the formation of A beta in the brain. 52KD subtype BACE1 provides a basis and clues for the diagnosis of AD, the in-depth study of molecular targets and drug development.
【技术实现步骤摘要】
促进大脑中Aβ累积的BACE1亚型的功能研发及应用
本专利技术属于生物工程中的DNA重组
，具体是基于BACE1选择性剪接机制的基因重组出一种对APP病理切割和Aβ形成的促进作用的BACE1亚型，并验证其对AD鼠记忆损伤和脑内Aβ形成的加剧作用，以及其为AD的诊断、分子靶点的深入研究及药物研发提供依据和线索。
技术介绍
阿尔茨海默症(Alzheimer'sdiseaseAD)是老龄化社会的重要疾病，并成为威胁老年人群健康的四大杀手之一。淀粉样蛋白Aβ在大脑中不断生成和累积，引起显著的淀粉样斑块形成和继发性神经损伤，是AD重要的发病机制。Aβ是由APP(淀粉样蛋白前体)分子病理切割形成的，而β-分泌酶(BACE1)是Aβ生成的主要限速酶，也是AD药物研发和分子机制研究的核心靶点。BACE1通常被认为是由501个氨基酸组成的55KD的蛋白酶，目前大部分的研究也将其作为靶点来进行AD的药物研发，然而多以失败告终，这提示了BACE1分子的复杂性。最新文献报道，BACE1的转录本通过选择性剪接机制可以产生分别编码含有501、476、457以及432个氨基酸的BACE1异构体，分别编码55KD，52KD，49KD和47KD的BACE1蛋白。B型I-476比起A型I-501在外显子4编码的区域缺少了25个氨基酸，C型I-457则在外显子3编码的区域内缺少了44个氨基酸，而D型I-432则同时缺失了B型I-476和C型I-457所缺失的所有氨基酸。在大脑内最为广泛表达的是A/型I-501，而其他三种形式在大脑中的表达量很低，主要在胰腺等组织中有所表达，所以研究者并没有关注其它三种形式对APP分子的切割功能。大脑内最广泛表达的A型BACE1的蛋白结构域包括N端信号肽和前肽区域，中部的成熟蛋白催化域，以及由17个氨基酸组成的跨膜区域和24个氨基酸组成的C端延伸尾【图1】。BACE1的N端和C端各含有一个天冬氨酸活性催化区域，这两个天冬氨酸残基对于BACE1的活性至关重要。BACE1含有6个保守的半胱氨酸残基(Cys)，并形成三对二硫键(Cys216/Cys420,Cys380/Cys330和Cys278/Cys44)，BACE1的二硫键可能与BACE1蛋白的正确折叠和定向有关。BACE1含有四个糖基化位点(Asn153，Asn172,Asn223和Asn354)，是BACE1的成熟的必要条件。与A型BACE1相比，B型BACE1缺失190-214位氨基酸，这一结构的改变是否会改变其功能，这值得我们深入研究。
技术实现思路
本专利技术是基于BACE1的选择性剪接和AD发生特点、治疗难点，通过生物工程专利技术一段特异的蛋白序列和核酸序列，证明其具有对APP病理切割和Aβ形成的促进作用，并通过动物实验验证其对AD鼠记忆损伤和脑内Aβ形成的加剧作用。本专利技术利用生物工程技术，基因重组一段476个氨基酸多肽对应的DNA序列到pcDNA3.1真核表达载体。经序列分析证明重组成功后，将此真核表达重组多肽转染到人胚肾细胞中，免疫印迹证明多肽的蛋白表达，实现了多肽的重组。接着对多肽的拮抗APP病理切割功能进行了研究，细胞学实验表明此多肽具有APP病理切割和Aβ形成的促进作用。然后通过动物体内注射，行为学实验和病理学实验都证明此多肽具有AD鼠记忆损伤和脑内Aβ形成的加剧作用本专利技术的多肽重组表达质粒是将此多肽对应DNA序列连接进pcDNA3.1真核表达载体，多肽N端氨基酸序列为：其对应的核苷酸序列为：第一步，52KD亚型BACE1真核表达质粒构建及其表达检测以pcDNA3.1-BACE1(55KD)为模板进行PCR。将PCR产物用DH5α感受态进行转化，并将转化出的菌落进行小量培养，然后将小量培养的菌液进行小量提取，最后将提取的质粒进行测序。将正确连接的多肽真核表达载体转染293T细胞，48小时后搜集样品，免疫印迹结果证明了此多肽的表达。第二步：52KD亚型BACE1的功能检测1.细胞学实验采用AD的细胞模型SHSY5Y的细胞上清液为样品，在共转染重组肽真核表达质粒和APP野生型质粒或APPSWE突变型质粒48h后，将细胞培养液离心，取1/100作为样品检测Aβ1-40和Aβ1-42的浓度。ELISA结果显示，52KD亚型的BACE1具有APP病理切割和Aβ形成加剧作用。2.小鼠体内实验选经过基因型鉴定的16月龄AD小鼠进行分组，相当于人类重度AD患者，每组分别腹腔注射高纯度的质粒，每周两次，每次每只20ug质粒，共2个月。在进行行为学检测后，将鼠脑进行固定包埋切片，通过免疫组化的方法检测脑内老年斑的形成及相关酶的变化。行为学和病理学结果显示52KD亚型的BACE1具有AD鼠记忆损伤和脑内Aβ形成的加剧作用。附图说明：图1为BACE1蛋白结构图；图2为构建BACE1突变质粒原理简图；图3为52KD亚型BACE1测序结果比对；图4为BACE1两种抗体原理图；图5为BACE1突变质粒表达验证原理；图6为BACE1突变质粒表达验证Westernblot分析；图7为ELISA检测AD细胞模型SHSY5Y细胞培养液中Aβ1-40的浓度；图8为ELISA检测AD细胞模型SHSY5Y细胞培养液中Aβ1-42的浓度；图9为腹腔注射BACE1对AD小鼠行为认知作用的实验设计；图10为质粒注射后AD小鼠Y迷宫入臂正确率统计图；图11为AD小鼠定位航行典型轨迹图及6天潜伏期折线统计图；图12为AD小鼠空间探索航行典型轨迹图及虚拟平台停留时间次数统计图；图13为三种BACE1抗体检测腹腔注射BACE1突变质粒在AD小鼠脑内过表达情况；图14为AD小鼠脑组织硫黄素染色及数理统计。具体实施方式：实施例1：52KD亚型BACE1真核表达质粒构建及其表达检测1、52KD亚型BACE1真核表达载体构建BACE1基因全长从Genebank得到，基因序列号为NM001207048。B型I-476(52KD)BACE1与A型I-501(55KD)BACE1相比缺失146-190aa【图2】，以pcDNA3.1-BACE1(55KD)为模板，上游引物为5'-CCAGGCTTTGTGGTGCTGGCTTCCCCCTCA-3'，下游引物为5'-CAAAGCCTGGCAATCTCAGCATAGGCCAGC-3'，进行PCR。将PCR产物用DH5α感受态进行转化，并将转化出的菌落进行小量培养，然后将小量培养的菌液以碱裂解法进行小量提取，最后将提取的质粒进行测序，并进行比对，突变成功【图3】。2、52KD亚型BACE1真核表达质粒的表达检测根据已有的两端特异性抗体【图4】，抗体BACE1190-214aa可以检测55KD、49KD这两种形式的BACE1，抗体BACE1146-189aa可以检测55KD、52KD这两种形式的BACE1；而已有的BACE1抗体可以检测55KD、52KD、49KD、47KD这四种亚型的BACE1。根据这三种抗体可以特异性识别的片段类型，设计了突变质粒表达验证实验【图5】。选择高转染效率的HEK293T细胞，在HEK293T细胞中过表达BACE1亚型的真核质粒，用上述三种抗体Westernblot检测，结果显示突变质粒均构建成功且可以表达【图6】。实施例2：52KD本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有对APP病理切割拮抗作用和Aβ形成加剧作用的BACE1亚型的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.具有对APP病理切割拮抗作用和Aβ形成加剧作用的BACE1亚型的核苷酸序列。2.具有对APP病理切割拮抗作用和Aβ形成加剧作用的BACE1亚型的氨基酸序列。3.52KD亚型BACE1具有对APP病理切割拮抗作用和Aβ形成加剧作用。4.52KD亚型BACE1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李晓萌，王娅，李佳乐，汪小莞，刘孜育，王译唱，李江，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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