一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备及其应用。一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒制备方法，包括（1）制备Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用，该平台成功制备Cre和Flp独立可控的重组伪狂犬病毒。本发明专利技术成功获得Cre和Flp独立依赖的表达荧光蛋白的重组伪狂犬病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法和应用。
技术介绍
人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一,有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双链DNA分子，约150kb，成熟病毒粒子含有约50种蛋白质，PRV除了具有疱疹病毒科成员的优点外，其不感染人，因而成为研究神经环路的重要工具。然而，野生型PRV毒力强，感染大鼠后3天左右即引起死亡，同时具有双向运动的特点，因此，限制了其在神经环路研究中的应用。而由野生型PRV衍生而来的疫苗株(PRV-Bartha)的毒性大大减弱，感染大鼠后10天才引起动物死亡，而且具有严格逆向传播的特点，大大提高了其在神经环路研究中的应用价值。目前为止，研究人员以PRV为对象，构建了一系列的带有荧光蛋白标签的重组PRV，并成功应用于神经网络结构和功能的研究。尽管如此，缺乏依赖于Cre和Flp表达不同颜色荧光蛋白和跨级运输的重组伪狂犬病毒。因此，本专利技术对于解析神经环路研究具有十分重要的意义。随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本专利技术建立了一种Cre和Flp系统依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒。将在解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法。本专利技术的另一个目的在于提供了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的应用，该重组病毒可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：1)Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的质粒构建：采用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQIDNO.13、SEQIDNO.10、SEQIDNO.7、SEQIDNO:22、SEQIDNO.16所示序列顺次插入载体pAAV-nEFCon/FonhChR2(H134R)-EYFP(addgene,55644#)，获得克隆命名为pleftarm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-CMV-BFP-rightarm。2)Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组病毒的制备：将步骤1)中的克隆转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养上清，纯化，即得重组伪狂犬病毒PRV527。利用上述制备方法制得的重组伪狂犬病毒的应用，所述的应用包括但不限于利用本专利技术提供的重组伪狂犬病毒建立伪狂犬病毒的药物筛选平台，研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制、伪狂犬病毒病毒疫苗和诊断试剂的研发、伪狂犬病毒感染的动物模型的建立、伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析、或是对哺乳动物的脑神经环路进行示踪。对哺乳动物的脑神经环路进行示踪，具体的，示踪包括下述步骤：取0.1μlLV551定位注射到鼠脑，感染后3周后取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同脑区；另外，取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同脑区(作为对照，没有注射过LV551的鼠)。感染后5天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；对脑片使用荧光显微镜观察。或是下述应用步骤：取0.1μlLV553定位注射到鼠脑，感染后3周后取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同脑区；另一方面，取0.1μl重组伪狂犬病毒PRV527定位注射到鼠脑相同区域(作为对照，没有注射过LV551的鼠)。感染后5天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。所述的LV551和LV553病毒，其制备方法包括：1)具备表达Cre/TK和Flp/TK能力的辅助病毒：用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQIDNO.26和SEQIDNO.25插入质粒3rdgenlentiviralplasmidwithhUbC-drivenEGFP(14883#，addgene)，获得克隆命名为pCre-F2A-nlsDsred-T2A-TK的质粒；将SEQIDNO.31和SEQIDNO.32插入14883#(addgene)，获得克隆命名为pFlp-T2A-TK的质粒。2)表达Cre/TK和Flp/TK能力的辅助病毒的制备：将pCre-F2A-nlsDsred-T2A-TK与商业化的包装质粒(pGAG/POL、pREV和pVSVG，SystemBiosciences)共转染293T细胞制备辅助病毒LV551；将pFlp-T2A-TK与商业化的包装质粒(pGAG/POL、pREV和pVSVG，SystemBiosciences)共转染293T细胞制备辅助病毒LV553。所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猪等动物的神经环路标记；本专利技术所用的绿色荧光蛋白基因和红色荧光蛋白基因只是作为一个范式，因此，还可用其他外源基因替代本专利技术的荧光蛋白基因。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：1.本专利技术制备了一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒，其能够分别在Cre和Flp的控制下实现荧光蛋白的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：1）Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的质粒构建：采用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO.16所示序列顺次插入载体pAAV‑nEF Con/Fon hChR2(H134R)‑EYFP，获得克隆命名为pleft arm‑FDIO‑mCherry‑DIO‑EGFP‑CMV‑BFP‑right arm;2）Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组病毒的制备：将步骤1）中的克隆转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养上清，纯化，即得重组伪狂犬病毒PRV527。

【技术特征摘要】
1.一种Cre和Flp依赖的逆向示踪重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：1）Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的质粒构建：采用PCR扩增、酶切重组的方式将SEQIDNO.13、SEQIDNO.10、SEQIDNO.7、SEQIDNO:22、SEQIDNO.16所示序列顺次插入载体pAAV-nEFCon/FonhChR2(H134R)-EYFP，获得克隆命名为pleftarm-FDIO-mCherry-DIO-EGFP-CMV-BFP-rightarm;2）Cre和Flp依赖表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的重组病毒的制备：将步骤1）中的克隆转染BHK21细胞后感染伪...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾凡，徐富强，徐小琴，缪欢，吕培，
申请(专利权)人：中国科学院武汉物理与数学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42