人源化基因改造动物模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化PD‑L1基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Preparation and application of the animal model of humanized gene transformation

The present invention relates to transgenic non-human animal humanized gene, especially genetically modified rodents, but especially the genetically engineered mice, application of construction method relates to humanized PD L1 gene in animal model and in the field of biology and medicine.

【技术实现步骤摘要】
人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
本申请涉及人源化基因动物模型的建立方法和应用，具体而言，涉及基于一种人源化PD-L1基因动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012年全球恶性肿瘤发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例为307万，死亡人数220万。近年，针对免疫检查点的抗体药物研发被认为是有望攻克各类癌症的潜在靶点。传统的药物研发中，都是采用体外药效筛选的方式，该筛选方法不能模拟体内环境(如肿瘤微环境、基质细胞、胞外基质成分以及免疫细胞互动等)，造成研发失败率较高。另外，鉴于人和动物的差异，使用常规实验动物进行体内药理药效检测结果，并不能反映真实的疾病状态和靶位点的识别互动，导致许多临床试验的结果与动物实验的结果相去甚远。因此，开发适合人源抗体筛选和评价的人源化动物模型，将可显著提高新药开发效率，并降低研发成本。PD-1(programmeddeath-1)主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)，广泛表达于抗原提呈细胞(APCs)等。PD-1与其配体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。据科睿唯安(ClarivateAnalytics，原汤森路透知识产权与科技事业部)统计，截至2017年6月，全球处于活跃状态的PD-1、PD-L1药物有125个，几乎所有的跨国公司(MNC)都投入了该靶点的研发中，目前已有3个PD-L1抗体药物被FDA批准，分别是罗氏开发的PD-L1抗体Atezolizumab、默克/辉瑞合作开发的抗PD-L1单抗Avelumab以及阿斯利康开发的Durvalumab。除单药外，PD-L1抗体也在进行联用的尝试，如Durvalumab目前与13个不同机制的药物进行联用，包括OX40，MEK，CTLA4等。由于免疫疗法有较明显的免疫毒性，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免，因此严格的药物筛选程序非常重要。但由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而人源化动物模型则能很好地“复制”人类某些疾病特征，这种模型通常被用做人类疾病研究的活体替代模型，用于临床前药物研发的动物体内药效检测实验。人源化动物模型的应用很广泛，比如在肿瘤、艾滋病、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有很强的适用性。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类疾病特征的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)，已经为临床前和临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即，利用基因修饰技术，用人类正常或突变基因替换动物同源基因，可在动物体内建立含有人类疾病特征的正常或突变基因的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升人源细胞移植人源化小鼠模型的成功率，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少临床前动物实验与临床实验的差异，为在动物水平进行临床前药物筛选提供了可能。
技术实现思路
专利技术概述为了解决上述问题，本申请专利技术人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物PD-L1基因的特定片段被人PD-L1基因特定片段替换，本申请专利技术人成果得到世界首例PD-L1基因人源化小鼠。成功制备PD-L1基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达PD-L1蛋白，可用于PD-L1基因功能研究、人源PD-L1抗体的筛选和评价。利用本专利技术的制备方法成功制备PD-L1基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达PD-L1蛋白，可用于PD-L1基因功能研究、人源PD-L1抗体的筛选和评价利用本专利技术制备的动物模型可用于针对人PD-L1靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。综合来说，对于研究PD-L1蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。另外，本专利技术得到了PD-L1基因敲除的小鼠，同时本专利技术的小鼠可与PD-1人源小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，得到双人源化鼠。可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价。专利技术的详细说明本专利技术涉及一种导入人PD-L1基因的非人动物或其子代的制备方法，导入人PD-L1基因、使得该人PD-L1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的PD-L1蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Pd-l1基因的表达。本专利技术涉及一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源PD-L1基因，所述方法包括：(a)构建含有人PD-L1基因的载体，通过基因工程方法将所述人PD-L1基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Pd-l1基因缺失或使得内源/动物来源的Pd-l1基因不具有功能；并且(b)在所述非人动物体内表达人源PD-L1基因。本专利技术涉及一种制备基因修饰/改造的非人动物的方法，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的PD-L1基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含在内源/动物来源的Pd-l1基因座，用人PD-L1胞外域编码序列取代内源/动物来源的Pd-l1胞外域编码序列的部分或全部。本专利技术涉及一种人源化动物模型构建的方法，所述动物模型基因组中包括PD-L1基因，PD-L1基因的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中PD-L1基因的胞内参与信号传导的部分为动物来源，PD-L1基因的胞外区域包含人PD-L1基因的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Pd-l1启动子后；优选的，PD-L1基因的跨膜区为动物来源。本专利技术还涉及一种人源化动物模型构建的方法，其中所述动物来源的PD-L1包括动物来源Pd-l1基因的第1号外显子的全部、第2号外显子的全部、第3号外显子的部分序列、第4号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或人PD-L1基因部分为编码人类PD-L1多肽的氨基酸的第3号外显子的部分或全部序列。在本专利技术的一个实施例中，涉及一种人源化动物模型构建的方法，其中，所述动物来源的Pd-l1基因为啮齿类动物来源的Pd-l1基因；优选的，所述啮齿类动物为小鼠；更优选的，所述小鼠Pd-l1的mRNA序列的全部或部分片段如SEQIDNO：26中的全部或部分片段所示。在本专利技术的一个实施例中，其中，小鼠Pd-l1的蛋白序列的全部或部分片段如SEQIDNO：27中的全部或部分片段所示。在本专利技术的另一个实施例中，所述人PD-L1基因的全部或部分片段的人P本文档来自技高网...

【技术保护点】
导入人PD‑L1基因的非人动物或其子代的制备方法，其特征在于，导入人PD‑L1基因、使得该人PD‑L1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的PD‑L1蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Pd‑l1基因的表达。

【技术特征摘要】
2016.08.31 CN 20161077538241.导入人PD-L1基因的非人动物或其子代的制备方法，其特征在于，导入人PD-L1基因、使得该人PD-L1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的PD-L1蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Pd-l1基因的表达。2.一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源PD-L1基因，所述方法包括：(a)构建含有人PD-L1基因的载体，通过基因工程方法将所述人PD-L1基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Pd-l1基因缺失或使得内源/动物来源的Pd-l1基因不具有功能；并且(b)在所述非人动物体内表达人源PD-L1基因。3.一种制备基因修饰/改造的非人动物的方法，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的PD-L1基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含在内源/动物来源的Pd-l1基因座，用人PD-L1胞外域编码序列取代内源/动物来源的Pd-l1胞外域编码序列的部分或全部。4.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括PD-L1基因，PD-L1基因的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中PD-L1基因的胞内参与信号传导的部分为动物来源，PD-L1基因的胞外区域包含人PD-L1基因的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Pd-l1启动子后；优选的，PD-L1基因的跨膜区为动物来源。5.一种如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，其中，动物来源的PD-L1包括动物来源Pd-l1基因的第1号外显子的全部、第2号外显子的全部、第3号外显子的部分序列、第4号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或人PD-L1基因部分为编码人类PD-L1多肽的氨基酸的第3号外显子的部分或全部序列。6.一种如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，其中，动物来源的Pd-l1基因为啮齿类动物来源的Pd-l1基因。7.一种如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物为小鼠。8.一种如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中，小鼠Pd-l1的mRNA序列的全部或部分片段如SEQIDNO：26中的全部或部分片段所示。9.一种如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中，小鼠Pd-l1的蛋白序列的全部或部分片段如SEQIDNO：27中的全部或部分片段所示。10.一种如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其中，人PD-L1基因的全部或部分片段的人PD-L1mRNA序列如SEQIDNO：28中的全部或部分片段所示。11.一种如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其中，人PD-L1全部或部分片段的蛋白序列如SEQIDNO：29中的全部或部分片段所示。12.一种如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，其中，动物模型基因组中包括嵌合PD-L1基因，所述嵌合PD-L1基因包括小鼠来源的Pd-l1基因部分和人源的PD-L1基因部分，所述嵌合PD-L1基因mRNA序列与SEQIDNO：32所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。13.一种如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合PD-L1基因，所述嵌合PD-L1基因包括动物来源的Pd-l1基因部分和人源的PD-L1基因部分，所述嵌合PD-L1基因的嵌合mRNA序列如SEQIDNO：32的全部或部分所示。14.一种如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合PD-L1基因，所述嵌合PD-L1基因包括动物来源的Pd-l1基因部分和人源的PD-L1基因部分，编码所述嵌合PD-L1基因的蛋白序列与SEQIDNO：33所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。15.一种如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合PD-L1基因，所述嵌合PD-L1基因包括动物来源的Pd-l1基因部分和人源的PD-L1基因部分，所述嵌合PD-L1基因的蛋白序列如SEQIDNO：33的部分或全部所示。16.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的PD-l1的第3号外显子全部或部分序列替换为人源PD-L1的第3号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQIDNO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQIDNO：8-16任一项所示。17.一种PD-l1敲除动物模型构建的方法，其特征在于，将动物体内的Pd-l1的第3号外显子全部或部分敲除，使得内源Pd-l1蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQIDNO：1-7任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQIDNO：8-16任一项所示。18.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将序列如SEQIDNO：1-7所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQIDNO：8-16所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；优选的，所述sgRNA靶序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：10，获得的正向寡核苷酸序列如SEQIDNO：18或SEQIDNO：22所示；反向寡核苷酸序列如SEQIDNO：20或SEQIDNO：24所示，其中SEQIDNO：18和SEQIDNO：20为A组，SEQIDNO：22和SEQIDNO：24为B组；(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQIDNO：25所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNA载体的双链；(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。19.一种PD-l1基因敲除动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：按照权利要求18所述的步骤1-4，获得sgRNA载体；第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的PD-l1基因被敲除，获得Pd-l1基因敲除阳性小鼠；第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Pd-l1-/-小鼠；优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQIDNO：45-48所示。20.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)，其选自Pd-l1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)，其选自Pd-l1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。21.一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向PD-L1基因，同时所述sgRNA在待改变的PD-L1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；优选的，所述sgRNA在小鼠Pd-l1基因的靶位点位于小鼠Pd-l1基因的第3外显子上。更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：1-7任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：8-16任一项所示；进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQIDNO：1所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQIDNO：10所示。22.一种建立PD-L1基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：(a)提供一种细胞，所述细胞包括权利要求20所述的靶向载体以及一种或多种靶位点的序列如1-16所示的sgRNA序列的体外转录产物，优选的所述细胞为受精卵细胞；(b)将所述细胞在培养液中进行培养；(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。23.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在于，(a)利用权利要求1-17、19或22任意一项所述方法获得动物模型；(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，白阳，郭雅南，黄蕤，周小飞，郭朝设，
申请(专利权)人：北京百奥赛图基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11