斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白制造技术

本发明专利技术公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白，本发明专利技术提供的基因不仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8在卵巢发育中的作用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础；其技术要点，该基因序列如SEQ ID NO:1所示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；属于生物基因技术领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白，属于生物基因

技术介绍
细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期(即G1时期、S时期和G2时期)和细胞分裂期(即M时期)，在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。CDK8是细胞核丝氨酸-苏氨酸激酶，功能是与cyclin C结合，作为DNA结合转录因子和RNA聚合酶II的中介蛋白复合体的重要亚基，参与细胞的转录调节。CDK8与转录起始相关的TFIIH(cyclin H/CDK7/Mat1复合物)、Med12、Med13、RNAPII等相互作用共同调控转录的起始。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，CDKs的激酶活性取决于结合的细胞周期蛋白(cyclin)和全酶的完整性，cyclin通过与CDKs特异性结合位点的结合调控底物专一性的CDKs的激酶活性，CDKs主要参与调控细胞周期、转录和神经元功能，哺乳动物中报道的CDKs约有20种，包括CDK1-CDK19。其中CDK8作为转录起始过程中重要的调控因子在人的研究中最为广泛和深入，大多集中在肿瘤治疗和细胞信号通路方面。1995年人们在寻找依赖cyclinC的激酶时确认了CDK8，并通过实验证明CDk8在生物体内和体外都能够和cyclin C结合，CDK8作为细胞生长调控的中间信号，之后的实验验证了CDK8在转录调控中的重要作用。近年来CDK8和cyclin C的异常表达经常在各类人类肿瘤中发现，尤其在结肠和直肠癌中的研究较多。CDK8作为中介蛋白复合体的关键组分在转录等过程中的作用机理是当前研究的热点。继人CDk8(Homo sapiens，NM_001260.1)被克隆出来以后，其它物种的CDK8也得到了不同程度的研究，如小鼠(Mus musculus，NM_153599.3)、斑马鱼(Danio rerio，NM_194408.1)、果蝇(Drosophila melanogaster，U33015.1)等，但在对虾中的研究还较少。斑节对虾(Penaeus monodon)是世界三大对虾养殖品种之一，人工育种过程中广泛采用的剪除单侧眼柄的技术会导致亲虾的高死亡率和产卵质量低等问题。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的全表达序列；此外通过斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因设计荧光定量PCR引物，对细胞周期蛋白依赖性激酶8在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情况进行研究分析。本专利技术构建了细胞周期蛋白依赖性激酶8原核表达重组质粒，通过原核表达和亲和层析技术在体外成功获得重组蛋白。本专利技术提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，该基因序列如SEQ ID NO:1所示。该基因的制备方法依次包括下述步骤：1、总RNA的提取取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组织，并分别将组织于1mL Trizol(Invitrogen，日本)中匀浆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80℃保存。2、cDNA第一链的合成取上述斑节对虾总RNA 2μL与反转录引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16<3)1μL(10pmol/L)混合在反转录酶(M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA一链，反应条件：42℃60min，70℃15min。3、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的PCR扩增、克隆根据已获得EST序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术和半巢式PCR技术扩增斑节对虾CDK8基因的3′和5′未知序列。在3′RACE中，一扩使用正向引物K8FSP1(5>CTCCAGAGAGTATTCCTTTCACACG<3)和接头通用引物AP(5>GGCCACGCGACTAGTAC<3)；二扩使用正向引物K8FSP2(5>GCAGGTCACAAAGGGAATGGTCAAG<3)和接头通用引物AP(5>GGCCACGCGACTAGTAC<3)。在5′RACE中，以K8RSP1(5>TGCTGACATAGACAATCCAGTGCCT<3)和oligo-dG为引物进行一扩，用K8RSP2(5>GGATGTTTCAACTCTCGCAGCAATG<3)和oligo-dG(5>GGGGGGGGGGGGGGG<3)进行二次PCR。4、对斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的测定所得到的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因同源序列。5、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的分布和表达提取健康的斑节对虾不同组织(包括卵巢、肝胰腺、脑、心、肠、血和淋巴)以及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)操作手册进行反转录为cDNA模板。将不同组织样品cDNA稀释1倍作为模板，采用SYBR GreenⅠ染料法，在Roche荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。依照TaKaRaPrimeScriptTMRTPCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行PCR反应。反应体系为10μL，包含5μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix，3μL稀释的模板，各0.2μL正、反引物(10μmol/L)及1.6μL的双蒸水。每个时间点设置3个重复。反应参数为95℃预变性10s；然后95℃变性15s，60℃退火延伸20s，共45个循环。使用引物reCDK8-F(5>TGACTTTCGGACTGTTTCGC<3)和reCDK8-R(5>TTCCTTTCCCCTTACGCTTT<3)扩增目标基因，RTEF-F(5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3)和RTEF-R(5>CGTGGTGCATCTCCAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID 
NO:1所示。
2.权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因编码的蛋白，其特征在于，
所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1或者2所述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8在斑节对虾不同组织和
发育各时期分布、表达。
4.含有权利要求1或2所述基因的重组质...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱丽华，傅明骏，赵超，郭松，江世贵，周发林，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44