使用细胞分裂基因座控制细胞增殖的工具和方法技术

本披露提供了用于使用细胞分裂基因座(CDL)控制动物细胞中的细胞增殖的分子工具、方法和试剂盒。如本文提供的，CDL是在细胞分裂期间其一种或多种转录产物被表达的基因座。如本文所述的，CDL可以被基因修饰成包括阴性选择标记和/或基于诱导型激活物的基因表达系统，其允许用户通过添加或除去适当的诱导物来允许、消融和/或抑制一个或多个基因修饰细胞的增殖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用细胞分裂基因座控制细胞增殖的工具和方法在先申请的交叉引用根据巴黎公约，本申请要求2015年3月9日提交的美国临时专利申请62/130,258和2015年3月9日提交的美国临时专利申请62/130,270的优先权，将其各自通过引用如其全文所述并入本文。
本说明书总体上涉及细胞和分子生物学领域。更具体地说，本说明书涉及用于控制动物细胞分裂和与其相关的基因修饰的细胞的分裂的分子工具、方法和试剂盒。
技术介绍
人类多能干(hPS)细胞可以被用作用于理解正常细胞发育、疾病发展和用于在治疗目前无法治愈的障碍(例如像，遗传性障碍、退行性疾病和/或各种损伤)的细胞治疗中使用的工具。这些细胞的多能性质使其能够在干细胞状态下自我更新一段时间之后分化成任何细胞类型(Rossant和Nagy，1999)。hPS细胞的黄金标准是1998年报道的人类胚胎干(hES)细胞(Thomson等人，1998)。在2006年和2007年，报道了将分化的体细胞(如皮肤成纤维细胞)重编程为ES细胞样“诱导多能干”(iPS)细胞的方法并扩展了多能细胞的类型(Takahashi和Yamanaka，2006；Takahashi等人，2007)。从那时候开始，产生iPS细胞的方法及其在许多方面的应用(包括用于治疗疾病和异常生理病症的基于细胞的疗法)已经得到进一步发展。关于基于多能细胞的疗法的一个问题是安全性。例如，源于细胞移植物的恶性生长是令人担忧的。将分化细胞重编程为iPS细胞的过程也与安全性相关，因为已经报道重编程方法可引起基因组损伤和异常表观遗传改变(Hussein等人，2011；Laurent等人，2011；Lister等人，2011)，这可能会导致iPS细胞来源的细胞恶性转化的风险。涉及体外扩增的多能细胞的基于细胞的疗法的一个挑战是细胞本身的多能性质。例如，如果多能细胞仍在分化的治疗性细胞中，则多能细胞可能发展成畸胎瘤(Yoshida和Yamanaka，2010)。提高多能细胞来源的产品和疗法的安全性的尝试包括在体外分化之后从细胞培养物中消除多能细胞的努力。例如：细胞毒性抗体已经被用于消除具有多能特异性抗原的细胞(Choo等人，2008；Tan等人，2009)；已经基于多能性细胞表面标记物分选细胞(Ben-David等人，2013a；Fong等人，2009；Tang等人，2011)；已经在细胞中基因改变肿瘤进展基因(Blum等人，2009；Menendez等人，2012)；已经在细胞中引入用于辅助分化细胞分离的转基因(Chung等人，2006；Eiges等人，2001；Huber等人，2007)；已经在细胞中引入自杀基因并用于消除分化之后的残留多能干细胞(Rong等人，2012；Schuldiner等人，2003)；并且已经使用化学物质消融了不希望的多能细胞(Ben-David等人，2013b；Dabir等人，2013；Tohyama等人，2013)。可能的是即使残留的多能细胞被从分化培养物中消除，多能细胞的分化衍生物仍可能具有致癌特性(Ghosh等人，2011)。相关的致癌事件可能发生在治疗性细胞中i)在体外制备细胞期间；或ii)将细胞移植入宿主体内后。目前用于消除或阻止不想要的细胞生长和/或分化的大多数策略都是基于单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)阴性选择系统，其可以用于完全消除移植物(如果发展成恶性肿瘤的话)(Schuldiner等人，2003)或仅消除‘污染’预期的分化衍生物的多能细胞(Ben-David和Benvenisty，2014；Lim等人，2013)。GCV诱导的细胞杀伤和凋亡的机制是很好理解的。它产生DNA双链断裂的复制依赖性形成(Halloran和Fenton，1998)，其导致凋亡(Tomicic等人，2002)。然而，许多基于HSV-TK/GCV的系统不可靠地表达，至少因为它们依赖于HSV-TK的随机整合或瞬时表达。已经测试了涉及具有不同杀伤机制的阴性选择性标记的策略，例如像半胱天冬酶9(DiStasi等人，2011)，但是尚未显示阴性选择标记的可靠表达。基于细胞的疗法可能需要数百万或数十亿的细胞，这可以放大由不想要的细胞生长和/或分化引起的任何问题。本披露的目的是减轻和/或消除上述一个或多个缺陷。
技术实现思路
在一个方面中，提供了控制动物细胞增殖的方法。该方法包括：提供动物细胞；基因修饰动物细胞中的细胞分裂基因座(CDL)，该CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个基因座；CDL的基因修饰包括以下项中的一种或多种：a)消融连接(ablationlink，ALINK)系统，该ALINK系统包括编码转录地连接至编码CDL的DNA序列的阴性选择标记的DNA序列；和b)调节CDL的诱导型外源性激活物(EARC)系统，该EARC系统包括可操作地连接至CDL的基于诱导型激活物的基因表达系统；用阴性选择标记的诱导物控制包括ALINK系统的基因修饰动物细胞的增殖；和/或用基于诱导型激活物的基因表达系统的诱导物控制包括EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖。在本文提供的控制动物细胞增殖的方法的一个实施例中，控制ALINK修饰的动物细胞包括以下项中的一种或多种：通过在不存在阴性选择标记的诱导物的情况下维持包括ALINK系统的基因修饰动物细胞来允许包括ALINK系统的基因修饰动物细胞的增殖；以及通过使包括ALINK系统的动物细胞暴露于阴性选择标记的诱导物来消融包括ALINK系统的基因修饰动物细胞或抑制其增殖。在本文提供的控制动物细胞增殖的方法的一个实施例中，控制EARC修饰的动物细胞包括以下项中的一种或多种：通过使包括EARC系统的基因修饰动物细胞暴露于基于诱导型激活物的基因表达系统来允许包括EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖；以及通过在不存在基于诱导型激活物的基因表达系统的诱导物的情况下维持包括EARC系统的动物细胞来阻止或抑制包括EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖。在本文提供的控制动物细胞增殖的方法的不同实施例中，CDL的基因修饰包括用以下项中的一种或多种进行CDL的靶向置换：a)包括ALINK系统的DNA载体；b)包括EARC系统的DNA载体；以及c)包括ALINK系统和EARC系统的DNA载体。在本文提供的控制动物细胞增殖的方法的不同实施例中，CDL的ALINK基因修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的和/或其中EARC基因修饰确保通过EARC修饰的等位基因可以仅产生功能性CDL修饰。在本文提供的控制动物细胞增殖的方法的不同实施例中，CDL是表2中所述的一个或多个基因座。在不同实施例中，CDL编码其功能涉及以下项中的一种或多种的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译以及代谢。在不同实施例中，CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5和Eef2/EEF2中的一个或多个，优选地CDL是Cdk1或CDK1。在本文提供的控制动物细胞增殖的方法的不同实施例中，ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统，优选地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制动物细胞增殖的方法，该方法包括：‑提供动物细胞；‑基因修饰该动物细胞中的细胞分裂基因座(CDL)，该CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个基因座，该CDL的基因修饰包括以下项中的一种或多种：a)消融连接(ALINK)系统，该ALINK系统包括编码转录地连接至编码该CDL的DNA序列的阴性选择标记的DNA序列；和b)调节CDL的诱导型外源性激活物(EARC)系统，该EARC系统包括可操作地连接至该CDL的基于诱导型激活物的基因表达系统；‑用该阴性选择标记的诱导物控制包括该ALINK系统的基因修饰动物细胞的增殖；和/或‑用该基于诱导型激活物的基因表达系统的诱导物控制包括该EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.09 US 62/130,258;2015.03.09 US 62/130,2701.一种控制动物细胞增殖的方法，该方法包括：-提供动物细胞；-基因修饰该动物细胞中的细胞分裂基因座(CDL)，该CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个基因座，该CDL的基因修饰包括以下项中的一种或多种：a)消融连接(ALINK)系统，该ALINK系统包括编码转录地连接至编码该CDL的DNA序列的阴性选择标记的DNA序列；和b)调节CDL的诱导型外源性激活物(EARC)系统，该EARC系统包括可操作地连接至该CDL的基于诱导型激活物的基因表达系统；-用该阴性选择标记的诱导物控制包括该ALINK系统的基因修饰动物细胞的增殖；和/或-用该基于诱导型激活物的基因表达系统的诱导物控制包括该EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖。2.如权利要求1所述的方法，其中该ALINK修饰的动物细胞的控制包括以下项中的一种或多种：-通过在不存在该阴性选择标记的诱导物的情况下维持包括该ALINK系统的基因修饰动物细胞来允许包括该ALINK系统的基因修饰动物细胞的增殖；和-通过使包括该ALINK系统的动物细胞暴露于该阴性选择标记的诱导物来消融包括该ALINK系统的基因修饰动物细胞或抑制其增殖。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该EARC修饰的动物细胞的控制包括以下项中的一种或多种：-通过使包括该EARC系统的基因修饰动物细胞暴露于该基于诱导型激活物的基因表达系统来允许包括该EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖；和-通过在不存在该基于诱导型激活物的基因表达系统的诱导物的情况下维持包括该EARC系统的动物细胞来阻止或抑制包括该EARC系统的基因修饰动物细胞的增殖。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该CDL的基因修饰包括用以下项中的一种或多种进行该CDL的靶向置换：a)包括该ALINK系统的DNA载体；b)包括该EARC系统的DNA载体；和c)包括该ALINK系统和该EARC系统的DNA载体。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该CDL的ALINK基因修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的和/或其中该EARC基因修饰确保通过EARC修饰的等位基因可以仅产生功能性CDL修饰。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该CDL是表2中所述的一个或多个基因座。7.如权利要求6所述的方法，其中该CDL编码其功能涉及以下项中的一种或多种的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译以及代谢。8.如权利要求7中任一项所述的方法，其中该CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5和Eef2/EEF2中的一个或多个，优选地该CDL是Cdk1或CDK1。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该ALINK系统包括单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统、羧基酯酶/伊立替康系统或iCasp9/AP1903系统，优选地该ALINK系统是单纯疱疹病毒-胸苷激酶/更昔洛韦系统。10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该EARC系统是dox桥系统、cumate开关诱导型系统、蜕皮激素诱导型系统、无线电波诱导型系统或配体可逆二聚化系统，优选地该EARC系统是dox桥系统。11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中该动物细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。12.如权利要求11所述的方法，其中该哺乳动物细胞是人类、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、猫、狗、奶牛、马、鹿、麋鹿、野牛、公牛、骆驼、美洲驼、兔、猪、山羊、绵羊或非人灵长类动物细胞，优选地该哺乳动物细胞是人类细胞。13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该动物细胞是多能干细胞、多潜能细胞、单能祖细胞或终末分化细胞。14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中该动物细胞衍生自多能干细胞、多潜能细胞、单能祖细胞或终末分化细胞。15.一种根据权利要求1至14中任一项所述的方法控制动物细胞群体增殖的方法。16.一种被基因修饰成包括至少一种用于控制细胞增殖的机构的动物细胞，该基因修饰动物细胞包括：-一个或多个细胞分裂基因座(CDL)的基因修饰，该CDL是其一种或多种转录产物由分裂细胞表达的一个或多个基因座，该基因修饰是以下项中的一种或多种：a)消融连接(ALINK)系统，该ALINK系统包括编码转录地连接至编码该CDL的DNA序列的阴性选择标记的DNA序列；和b)调节CEDL的外源性激活物(EARC)系统，该EARC系统包括可操作地连接至该CDL的基于诱导型激活物的基因表达系统。17.如权利要求16所述的基因修饰动物细胞，其中该CDL的基因修饰包括用以下项中的一种或多种进行该CDL的靶向置换：a)包括该ALINK系统的DNA载体；b)包括该EARC系统的DNA载体；c)包括该ALINK系统和该EARC系统的DNA载体。18.如权利要求16或17所述的基因修饰动物细胞，其中该CDL的ALINK基因修饰是纯合的、杂合的、半合子的或复合杂合的和/或其中该EARC基因修饰确保通过EARC修饰的等位基因可以仅产生功能性CDL修饰。19.如权利要求16至18中任一项所述的基因修饰动物细胞，其中该CDL是表2中所述的基因座中的一个或多个。20.如权利要求19所述的基因修饰动物细胞，其中该CDL编码其功能涉及以下项中的一种或多种的基因产物：细胞周期、DNA复制、RNA转录、蛋白质翻译以及代谢。21.如权利要求20所述的基因修饰动物细胞，其中该CDL是Cdk1/CDK1、Top2A/TOP2A、Cenpa/CENPA、Birc5/BIRC5和Eef2/EEF2中的一个或多个，优选地该CDL是Cdk1或CDK1。22.如权利要求16至21中任一项所述的基因修饰动物细胞，其中该A...

【专利技术属性】
技术研发人员：A纳吉，C莫内蒂，Q梁，
申请(专利权)人：西奈卫生系统公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA