一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体公开了一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法。本发明专利技术将表达睡美人转座酶的真核表达质粒和共表达抗性基因、不同响应元件驱动的报告基因，并在报告基因和共表达抗性基因两端插入转座子反向重复序列的真核表达质粒，共同转入宿主Jurkat T细胞，经加压筛选和单克隆分离得到稳定单克隆效应细胞，加入靶细胞和T细胞活化调节剂，通过测量报告基因的活性来测定T细胞免疫调节剂的生物活性。本发明专利技术可以应用于PD‑1/PD‑L1单抗、CTAL4‑Fc融合蛋白等细胞免疫调节剂的生物活性报告基因法检测体系。本发明专利技术不需要任何人血液来源的细胞成分或其它成分，测试结果稳定，操作简便，测试时间短，非常适宜后期对药物质量控制以及批次放行检测，可以广泛应用。

A new method for detecting biological activity of T cell immunomodulator

The invention relates to the field of biological medicine technology, and specifically discloses a new method for detecting biological activity of T cell immunomodulator. The expression of the invention of sleeping beauty transposase eukaryotic expression plasmid and co expression of reporter gene resistance gene and different response element driven, and the reporter gene and eukaryotic expression plasmid inserted into the transposon ends of resistance gene inverted repeats, common Jurkat T into host cells, and isolated by pressure screening monoclonal the effect of adding stable monoclonal cells, target cells and activation of T cell, T cell immune regulator regulator, determined by measuring the reporter gene activity to biological activity. The invention can be applied to the detection system of biological activity report CTAL4 L1 monoclonal antibody, Fc fusion protein cell immune regulator 1/PD PD gene. The invention does not require any cell components or other components from human blood source. The test results are stable, easy to operate, and short in testing time. It is very suitable for later drug quality control and batch release detection. It can be widely applied.

【技术实现步骤摘要】
一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法
本专利技术涉及生物医药
，具体地说是涉及一种采用睡美人转座子系统建立T细胞免疫调节剂的生物活性检测方法。
技术介绍
转座子又称可移动基因，跳跃基因，是一种可在基因组内插入和切离并能改变自身位置的DNA序列。早在20世纪50年代，首先由McClintock在玉米中发现，随后又陆续在细菌、真菌及动植物中发现，如细菌中的Tn5，酵母中的Ty以及来源于鳞翅目昆虫的piggyBac转座子等。睡美人(SleepingBeauty，SB)转座系统是Tc1/mariner转座子超家族中的一员，已经失活了一千多万年；1997年，Ivics等根据积累的系统发生数据，利用生物信息学的方法，对其进行分子重建，终于唤醒了其转座活性，恢复跳跃能力，因此被命名“睡美人”。SB转座子由两部分组成，转座酶基因和能够被转座酶识别的两端反向重复序列(terminalinvertedrepeat，ITR)。转座酶的开放式阅读框编码340个氨基酸的蛋白质，它可以与两端的反向重复序列相结合，促进转座的发生。两端的反向重复序列长约230bp，由外侧的32bp反向重复序列、内侧与IR相似的同向重复序列(DR)以及两者间相距165bp-166bp的片段3个部分等组成。DR是转座酶的结合区域，是转座子的严格保守区。SB转座子使用经典的“剪切-粘贴”(Cut-and-Paste)的作用机制进行转座。转座酶特异性识别DR，与细胞内的一种高度保守蛋白-高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox-1protein，HMGB1)结合形成突起复合物；此时，转座酶催化转座子的切除，释放转座子序列，并插入到新的整合位点上。一般情况下，SB转座子能特异性的整合到基因组中的TA双核苷酸位点。在实际的研究中，则是将SB转座子的两个功能成分(转座酶和ITR)分开，将这两个成分以双质粒系统进行构建；即将编码转座酶基因的序列从转座子中分离下来，构建成一个独立的表达载体，而转座酶基因原来的位置则可以被其它的DNA序列(兴趣基因及相关启动子等)代替，构建成另外一个载体；利用这种双质粒系统，SB转座子可以携带外源DNA序列整合到染色体上，并在细胞和体内稳定表达。显然地，睡美人转座子将成为天然并容易控制的DNA序列转移载体，并成为遗传工程包括基因治疗领域中广泛使用的工具。目前基因递送系统可以分为整合型和非整合型系统，其中能将外源基因稳定整合至真核宿主染色体的整合型系统包括逆转录病毒载体、慢病毒载体以及睡美人、piggyBac(PB)转座子系统。相对于其他常用的基因递送载体，睡美人转座子具有其无可比拟的优势：1.能将外源基因永久整合插入到宿主染色体基因组上；2.工业化生产简单、廉价；3.免疫原性低，体内安全性高；4.具有很大的外源基因包装能力，甚至可包装100kb以上的BACs。胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependentlymphocyte，简称T细胞)功能的抑制或激活在肿瘤免疫、自身免疫疾病及移植排斥反应中起着极为重要的作用。T细胞的激活依靠“双信号”系统精密细致的调控。一个激活信号来自于T细胞上的CD3/TCR(Tcellreceptor，T细胞受体)复合物与抗原提呈细胞或其它种类细胞上的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)及抗原复合物；另一个来自共刺激分子(CD28，OX40，4-1BB)和共抑制分子(CTLA4，PD-L1，PD-1)的信号传递。例如源自T细胞上的共刺激信号受体CD28与抗原提呈细胞上的CD80/86的结合，刺激T细胞激活。若对该信号通路进行调节，如通过CTLA-4竞争性抑制CD28与CD80/86的结合，可阻断第二信号共刺激信号通路。或者通过加入共抑制信号分子的抗体如抗CTLA-4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体，则可解除对T细胞激活的抑制。亦或加入抗CD3抗体竞争性结合CD3/TCR复合物，从而阻断第一信号通路，最终实现对T细胞活性进行调节(抑制或激活)的效果。基于此，涌现出大量已上市或在研的针对T细胞活化过程中所涉及的分子事件而设计的药物，以下统称为T细胞活化调节剂。对T细胞活化水平进行检测，是基于细胞水平的在开发此类药物时对其药效进行评估和生产中质量控制的重要指标。目前通用的T细胞活化调节剂的生物活性的测定方法，是采用混合淋巴细胞反应，通常是采用人外周血单核细胞(PBMC)进行生物活性测定，然而这种方法变异性大，成本高，方法耐用性和重复性较差。其测定方法为测试T细胞活化调节剂在混合淋巴细胞反应中对T细胞增殖和细胞因子IFN-Y和IL-2分泌产生的影响。使用人CD3+T细胞富集柱从PBMC中纯化人T细胞，每份培养物在200ul的总体积中包含105个纯化的T细胞和104个同种异基因的树突细胞；向每份培养物中加入不同浓度的T细胞活化调节剂，将细胞于37℃培养5天；5天后，从每份培养物中取出100ul培养基用于细胞因子的测量。采用细胞因子测试试剂盒来测量IFN-Y和IL-2等细胞因子的水平。同时可加入CCK8试剂[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]测试T细胞的增殖；此传统的生物活性测试方法需要采集分离足够多的新鲜人外周血单核细胞(PBMC)，通过长时间的(2-5天)培养后测定细胞增殖情况及上清中细胞因子的表达情况。这些传统的方法存在所需时间较长，成本较高，而且方法本身容易受到不同人体之间PBMC活性差异的影响，变异性较大等缺点。现有技术还不能解决上述技术困难。
技术实现思路
本专利技术采用睡美人转座子系统作为基因转移载体，将外源基因高效整合到T细胞，建立了一种新型T细胞免疫调节剂的生物活性检测方法。本专利技术用T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动报告基因的表达，并用睡美人转座子系统将其稳定整合至JurkatT细胞上，并同时加入第一信号和第二信号，通过测试报告基因的活性，来检测T细胞活化调节剂的生物活性。采用睡美人转座子建立的报告基因检测法不需要任何人血液来源的细胞成分或其他成分，测试结果稳定，操作简便，所需测试时间短，非常适宜后期对药物质量控制以及批次放行检测，可以广泛应用。本专利技术提供了一种用睡美人转座子系统建立T细胞活化调节剂生物活性的报告基因检测方法，所述方法包括：步骤一：T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因载体构建；所述报告基因为萤光素酶。步骤二：在萤光素酶基因两端插入睡美人转座子末端反向重复序列；步骤三：构建转座酶的表达载体；步骤四：将睡美人转座子的双质粒系统电转JurkatT细胞，筛选表达T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因的稳定细胞株；步骤五：对T细胞活化调节剂的生物活性进行检测，其检测方法包括：在第一信号和第二信号的共同作用下，步骤四中稳定细胞株被激活，T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因表达上调或下降，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基因的表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。其中，所述步骤一中，所述T细胞活化基因选自IL-2、NFAT、FoxP3、CD40、OX40、CD137或STAT3中的任一种，优选IL-2。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤一：T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因载体构建；所述报告基因为萤光素酶。步骤二：在萤光素酶基因两端插入睡美人转座子末端反向重复序列；步骤三：构建转座酶的表达载体；步骤四：将睡美人转座子的双质粒系统电转Jurkat T细胞，筛选表达T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因的稳定细胞株；步骤五：对T细胞活化调节剂的生物活性进行检测，其检测方法包括：在第一信号和第二信号的双信号系统共同作用下，步骤四中稳定细胞株被激活，T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因表达上调或下降，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基因的表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。

【技术特征摘要】
1.一种新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤一：T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因载体构建；所述报告基因为萤光素酶。步骤二：在萤光素酶基因两端插入睡美人转座子末端反向重复序列；步骤三：构建转座酶的表达载体；步骤四：将睡美人转座子的双质粒系统电转JurkatT细胞，筛选表达T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因的稳定细胞株；步骤五：对T细胞活化调节剂的生物活性进行检测，其检测方法包括：在第一信号和第二信号的双信号系统共同作用下，步骤四中稳定细胞株被激活，T细胞活化基因的反式转录调控元件驱动的报告基因表达上调或下降，同步加入T细胞活化调节剂，通过检测报告基因的表达量，定量评估T细胞活化调节剂生物学活性。2.根据权利要求1所述的新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法，其特征在于，所述步骤一中，所述T细胞活化基因选自IL-2、NFAT、FoxP3、CD40、OX40、CD137或STAT3中的任一种。3.根据权利要求2所述的新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法，其特征在于，所述T细胞活化基因为IL-2。4.根据权利要求1所述的新型T细胞免疫调节剂生物活性检测方法，其特征在于，所述步骤一中，所述反式转录调控元件选自IL-2启动子、CD28responseelement、NFATresponseelement或STAT3responseelement中的任一种。5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：文圣梅，陈龙，刘思，艾林，白义，
申请(专利权)人：北京东方百泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11