一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用制造技术

本发明专利技术属于动物生物技术领域，具体涉及一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用。发现了一种人miRNA序列的新功能，该miRNA序列被命名为miR‑4262，它是人miR‑4262的成熟序列，如SEQ ID NO：1所示。将miR‑4262序列转染Marc‑145细胞，转染24h后采用猪蓝耳病病毒(PRRSV)毒株感染Marc‑145细胞，感染24h后分别收集Marc‑145细胞和细胞培养的上清液，以荧光定量PCR方法分别检测细胞内与细胞外猪蓝耳病病毒病毒含量，表明miR‑4262序列能显著抑制PRRSV在Marc‑145细胞中的增殖与释放过程。本发明专利技术为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了设计靶点。

Application of miRNA as a inhibitor of porcine blue ear virus

The invention belongs to the field of animal biotechnology, and specifically relates to the application of a human miRNA as a pig blue ear virus inhibitor. A new function of human miRNA sequence is discovered. The miRNA sequence is named miR miR 4262, which is a mature sequence of human miR 4262, as shown by SEQ ID ID NO:1. The miR 4262 sequence was transfected into Marc 145 cells. After transfection of 24h, swine blue ear disease virus (PRRSV) virus was used to infect Marc 145 cells. After infected 24h, the 145 cells and the supernatant of cell culture were collected respectively. The content of the pig blue ear virus virus in cell and outside the cell was detected by the fluorescence quantitative PCR method, indicating that the miR 4262 sequence was 4262 sequence. Column can significantly inhibit the proliferation and release of PRRSV in Marc - 145 cells. The invention provides a design target for the research and development of a new type of prevention and control drug for pig blue ear disease.

【技术实现步骤摘要】
一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用
本专利技术属于动物生物
，具体涉及一个人miRNA作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用。
技术介绍
猪蓝耳病，又称繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS)是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)感染引起的一种危害极大的传染性免疫抑制性疾病，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。特别是近年来由高致病性PRRSV引起的突发疫情，导致仔猪致死率高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV具有变异快且复杂、免疫抑制、存在抗体依赖性增强作用等特征，目前采用疫苗等手段未能取得满意的效果，PRRS防制仍然是养猪业的重大难题之一。PRRSV有一个典型的生物学特征就是具有严格的宿主和细胞嗜性。它只感染猪，不感染其他物种，且主要感染单核巨噬细胞系中分化完全的细胞，尤其是猪肺泡巨噬细胞(PorcineAlveolarMacrophages，PAM)。在体外，PRRSV可在PAM和猴肾细胞系及其衍生细胞系(Marc-145、MA-104等)中增殖。宿主细胞膜上的一些特异性受体的存在与否决定了该细胞对PRRSV的易感性，而CD163就是PRRSV感染宿主细胞的最关键受体之一，它参与介导病毒的内吞和增殖[1]。例如，在PRRSV非易感细胞系(如BHK-21、PK-15、NLFK)中转染CD163真核表达质粒可以使这些细胞系感染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子[2-3]。采用CD163的抗体处理PAM细胞可以有效阻止PRRSV感染PAM[2]，且永生化的PAM细胞系因无法正常表达CD163而变为PRRSV非易感细胞[4]。不仅如此，CD163的表达量高低与PRRSV复制效率呈正相关，上调CD163表达会增加病毒增殖，而下调CD163表达可降低病毒增殖[5]。MicroRNA(miRNA)是一类长约22个碱基、高度保守的内源性非编码RNA分子，能够互补或部分互补的与靶mRNA结合，使mRNA降解或介导其翻译抑制，作为重要的转录后调节因子调控基因的表达[6]。miRNA几乎参与调控了各个领域的所有细胞生命活动的发生，在哺乳动物中它们可能负责调控约50％的编码基因[7]。在病毒感染和宿主天然免疫中，miRNA也发挥着重要作用，参与病毒与宿主的互作。[4,8][9-10]。研究报道miR-181c能靶向抑制PRRSV基因组和受体CD163基因，抑制PRRSV感染增殖。申请人发现一种人miRNA(miR-4262)能靶向CD163基因3’UTR序列，并能抑制PRRSV在细胞中的增殖，本专利技术为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了设计靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，合成一个人miR-4262序列，利用该序列作为抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在细胞中的复制与增殖作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，例如可以制备成试剂盒等的应用。申请人发现了一种人miRNA序列的新功能，申请人将该miRNA序列命名为miR-4262，它是人miR-4262的成熟序列，该序列如序列表SEQIDNO：1所示(即：GACAUUCAGACUACCUG)。将人工合成的miR-4262序列转染Marc-145细胞，转染24h后采用猪蓝耳病病毒(PRRSV)毒株感染Marc-145细胞，感染24h后分别收集Marc-145细胞和细胞培养上清液，用荧光定量PCR方法分别检测细胞内与细胞外猪蓝耳病病毒病毒含量，发现miR-4262序列能显著抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖与释放过程。本专利技术的技术方案如下所述：一种人miR-4262序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，专利技术要点在于，转染人miR-4262模拟物序列到易感细胞系，使其抑制猪蓝耳病病毒RNA在易感细胞中复制与释放，所述的步骤包括：(1)将SEQIDNO：1所示的人工合成的miR-4262序列与包含CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体利用脂质体共同转染到Marc-145细胞，所述的CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，利用双荧光素酶报告系统检测确定人miR-4262序列与猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因的3’UTR区域为靶向结合；(2)将所述的miR-4262序列通过脂质体转染到Marc-145细胞中，利用荧光定量PCR检测抑制猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因mRNA的表达量；(3)直接将人工合成的miR-4262成熟序列利用脂质体转染到猪蓝耳病病毒易感细胞系Marc-145中；转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染Marc-145细胞；(4)猪蓝耳病病毒株感染24h后，分别收集Marc-145细胞和Marc-145细胞培养的上清液，提取Marc-145细胞和Marc-145细胞培养的上清液的总RNA；(5)利用荧光定量PCR分别检测Marc-145细胞内与Marc-145细胞培养的上清液中猪蓝耳病病毒的RNA含量。本专利技术为猪蓝耳病新型防控药物研发提供了新的设计靶点。所述的序列可以作为制备体外检测猪蓝耳病病毒(PRRSV)药物或试剂的应用，例如可以制备成试剂盒等的应用。更详细的技术方案和专利技术效果如《具体实施方式》和《说明书附图》所述。附图说明序列表SEQIDNO：1是人miR-4262的成熟序列(或称之为人miR-4262序列)。序列表SEQIDNO：2是PCR扩增猪CD163基因3UTR序列。片段长度为469bp。序列表SEQIDNO：3是构建本专利技术构建的重组载体psi-CHECK2-CD163-3UTR的核苷酸序列。序列长度为6697bp。图1：是本专利技术的总体技术流程图。图2：是中间载体psi-CHECK2的结构图谱。图3：是重组载体psi-CHECK2-CD163-3UTR结构图谱。图4：是miR-4262序列和CD163基因3’UTR双荧光素酶报告载体共转染Marc-145细胞后的相对荧光素酶检测结果。附图标记说明：NC是转染阴性对照miRNA模拟物，miR-4262是转染miR-4262模拟物，**P<0.01。图5：是Marc-145细胞过表达miR-4262对CD163基因mRNA表达量影响。附图标记说明：Mock表示空白对照，NC-20nM、NC-50nM、NC-100nM表示分别转染20nM、50nM、100nM的阴性对照miRNA模拟物，miR-4262-20nM、miR-4262-50nM、miR-4262-100nM表示分别转染20nM、50nM、100nM的miR-4262模拟物，**P<0.01。图6：是商用载体pMD-18T的结构图谱。图7：是Marc-145细胞内PRRSVRNA相对定量检测结果。附图标记说明：Mock表示空白对照，NC表示转染阴性对照miRNA模拟物，miR-4262表示转染miR-4262模拟物，**P<0.01。图8：是Marc-145细胞培养的上清液PRRSVRNA绝对定量检测结果。附图标记说明：NC表示转染阴性对照miRNA模拟物，miR-4262序列表示转染miR-4262模本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个人miR‑4262序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，其特征在于，转染人miR‑4262模拟物序列到易感细胞系，使其抑制猪蓝耳病病毒RNA在易感细胞中复制与释放，步骤包括：(1)将SEQ ID NO：1所示的人工合成的miR‑4262序列与包含CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体利用脂质体共同转染到Marc‑145细胞，所述的CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，利用双荧光素酶报告系统检测确定人miR‑4262序列与猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因的3’UTR区域为靶向结合；(2)将所述的miR‑4262序列通过脂质体转染到Marc‑145细胞中，利用荧光定量PCR检测抑制猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因mRNA的表达量；(3)直接将人工合成的miR‑4262成熟序列利用脂质体转染到猪蓝耳病病毒易感细胞系Marc‑145中；转染24h后用猪蓝耳病病毒毒株感染Marc‑145细胞；(4)猪蓝耳病病毒株感染24h后，分别收集Marc‑145细胞和Marc‑145细胞培养的上清液，提取Marc‑145细胞和Marc‑145细胞培养的上清液的总RNA；(5)利用荧光定量PCR分别检测Marc‑145细胞内与Marc‑145细胞培养的上清液中猪蓝耳病病毒的RNA含量。...

【技术特征摘要】
1.一个人miR-4262序列作为猪蓝耳病病毒抑制物的应用，其特征在于，转染人miR-4262模拟物序列到易感细胞系，使其抑制猪蓝耳病病毒RNA在易感细胞中复制与释放，步骤包括：(1)将SEQIDNO：1所示的人工合成的miR-4262序列与包含CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体利用脂质体共同转染到Marc-145细胞，所述的CD163基因3’UTR的双荧光素酶报告载体的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，利用双荧光素酶报告系统检测确定人miR-4262序列与猪蓝耳病病毒关键细胞受体CD163基因的3’UTR区域为靶向结合；(2)将所述的miR-4262...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊静，梅书棋，彭先文，乔木，武华玉，刘贵生，宋忠旭，孙华，李良华，李明波，董斌科，雷彬，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42