病毒基因表达的抑制制造技术

本发明专利技术涉及修饰的小干扰RNA(siRNA)核酸分子，尤其是通过添加一个2-O胍基丙基修饰的核苷进行修饰的siRNA。特别地，本发明专利技术涉及能沉默靶标序列的修饰的siRNA，利用所述siRNA治疗和预防感染的方法，含有所述siRNA的药剂以及所述siRNA的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】病毒基因表达的抑制引言本专利技术涉及通过RNA干扰途径调苄基因表达的修饰的小干扰RNA分子(siRNA)。编码本专利技术所述siRNA的核酸分子包括能使它们的物理性质与野生型未修饰的siRNA相比产生差别的一个或多个修饰。在本专利技术一个优选的实施例中，所述siRNA的核酸序列包括至少一个具有2-0-胍基丙基(GP)结构的核苷。在本专利技术的进一步的实施例中，所述siRNA的修饰提高了该修饰的siRNA的稳定性，促进该修饰的siRNA导致的基因沉默并减少免疫刺激。
技术介绍
合成的RNA干扰(RNAi)激活剂显示出在病理基因沉默的治疗应用方面有着相当大的潜力。一些典型的外源RNA干扰激活剂包括约2 Ibp的在3'末端具拥有2个碱基悬垂的双链RNA。为了提高siRNAs的效果，在核糖的2' -OH基团进行化学修饰。使用这种方法已经证明可提高稳定性，促进基因沉默和减少免疫刺激。尽管这种方法有一定的作用，高效并可控的高负电荷核酸基因沉默子仍然是一个有待解决的问题。为了评估在2'位置引入正电荷基团的潜在实用性，我们主要对包含2-0-胍基丙基(GP)结构的新型siRNA的效果评估进行了研究。我们描述了所有四种用丙烯腈进行利用迈克尔加成反应然后进行雷尼镍还原并胍基丙基化的GP修饰的核苷。所使用的这些前体成功地生成抗肝炎B病毒(HBV)siRNA。在病毒复制的细胞培养模式中的实验表明所述GP修饰促进强化了基因沉默。此外，所述GP结构并不影响热力学稳定性，并且在siRNA的种子区域的每个位点导入GP结构并不改变预定HBV靶标的沉默效率。这些结果表明采用GP基团修饰的siRNA在推进合成的RNA干扰激活剂的治疗应用可能起到了一定的作用。使用合成的小干扰RNA (siRNA)来启动RNA干扰(RNAi)介导的基因沉默在治疗应用上具有相当大的潜力[1]，[2], [3]。典型地，siRNA为天然Dicer酶产物的合成模拟物，并且为在3'末端具有2个碱基悬垂的21-25个核苷酸(nt)双链。使用合成siRNA的进展得益于研究反义RNA分子的丰富经验。因此，加速了使用合成siRNA的发展并且siRNA效率的提高得以于有价值的生物的和合成化学的见解。合成的siRNA相比表达的RNA干扰激活剂的优势在于他们可修改的化学修饰以提高稳定性、安全性和特异性[4]，[5]。并且，利用化学合成程序可以实现临床应用所需的可控的大规模制备。然而，尽管具有如此显著的进步，这些聚阴离子的核酸穿过富含脂质的细胞膜的转运仍然是有问题的。用于运载合成RNA干扰激活剂至靶标细胞的载体包括包含脂质复合物的阳离子脂质[6]，共轭肽[7]或寡聚阳离子复合物，例如亚精胺[8]。然而，使用这些方法不一定都能成功。为了克服核酸的过多负电荷的困难，并同时提高热稳定性和血清稳定性，我们前期研究了一种利用阳离子基团进行核糖2'限定修饰的方法[9]，[10]。最初，我们经常得到2' -O-氨乙基-腺苷和2，-O-氨乙基-尿苷。合成限定初始步骤为用溴乙酸甲酯进行的烷化，然后紧接一系列的转化反应。利用荧光素酶报告基因分析来测定基因抑制，结果表明，2' -O-氨乙基修饰至少对W -O Me siRNA修饰是有效的。2' _0_氨乙基衍生物的一个重要特性是当化学修饰发生在siRNA随从链的3'端时它能够援救活性较低的siRNA[ll]。这种途径随后通过开发能够成功对所有四种核糖核苷进行烷化的方法得以改进[12]。这通过利用酞酰亚氨甲基三氟甲烷磺酸作为烷化剂并利用可以形成所有四种承载2' -O-氨乙基支链的亚磷酰胺的方法已经实现。虽然令人鼓舞，但利用这些siRNA试剂的一个问题在于多步化学合成的产率相当低。此外，扩大合成反应也很困难。为了解决这些问题，我们已经研究了一种替代的2-0-胍基丙基(GP)核苷修饰的实用方法。采用此处报道的该新方法，我们描述了利用丙烯腈进行迈克尔加成反应[13，14，15]然后进行雷尼镍还原[16]并胍基丙基化获得的所有四种GP修饰的核苷的结构。在B型肝炎病毒复制的细胞培养模型中利用之前显示适合基于RNA干扰的病毒复制抑制的靶标序列对GP siRNA的效率进行评估[17，18，19，20]。结果表明，相比未修饰的对应部分病毒复制标记显示出更高效的沉默。此外，所 述GP修饰的siRNA在血清条件下比未修饰的对照更稳定。
技术实现思路
本专利技术提供了修饰的核酸分子和包含所述修饰的核酸分子的制品。根据本专利技术的第一个方面，所述修饰的核酸分子包括修饰的小干扰RNA(SiRNA)核酸分子。所述修饰的siRNA分子包含一条正义链和一条反义链,并且所述正义链中至少一个核苷酸或反义链中至少一个核苷酸是衍生自2-0-胍基丙基(GP)修饰核苷。此外,所述核酸分子能够沉默靶标序列的表达，其中靶标序列是DNA或RNA序列。本专利技术指明了，所述至少一个修饰的核苷酸是选自由2-0-胍基丙基腺苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基胞苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基鸟苷亚磷酰胺和2-0-胍基丙基尿苷亚磷酰胺组成的组。此外，本专利技术还提供了包含前述各种亚磷酰胺的组合的siRNA。优选地，所述修饰的核酸分子的正、反义链的长度分别为18-26个核苷酸，优选地，长度为19-25个核苷酸，以及最优选地，长度为21个核苷酸。优选地，所述至少一个修饰的核苷酸可以位于所述正义链或/和反义链。此外，所述修饰的核酸分子的正义链和反义链优选地都包含人工合成序列。应理解的是，所述修饰的SiRNA可以包括一个以任何来自包括微生物、植物或动物的组织的DNA或RNA为靶标的siRNA。优选地，所述siRNA以微生物包括细菌和病毒的互补核酸分子作为靶标。更优选地，所述siRNA以病毒的互补核酸序列作为靶标。可以进一步理解的是，本专利技术中所述修饰的siRNA是核酸分子。在本专利技术优选的实施例中，所述修饰的siRNA抑制病毒复制。优选地，所述病毒是肝炎病毒，并且最优选地，所述病毒是B型肝炎病毒。本专利技术所述修饰的siRNA相比未修饰的siRNA，在转染进培养细胞和/或体内时，不会诱发可检测的干扰素反应。此外，所述修饰的siRNA相比包含相同序列的未修饰的siRNA,在标准血清分析中具有更大的稳定性。在进一步的实施例中,所述修饰的siRNA相比包含相同序列的未修饰的siRNA表现出更强的对靶标基因表达的抑制。在本专利技术优选的实施例中，所述反义链可以包含如SEQ ID NO:1所示的序列。此外，可以在反义链的 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和 / 或 21 等位点或这些位点的任意组合位点插入所述至少一个2-0-胍基丙基(GP)修饰的核苷。所述反义链包含如SEQ ID NO:1所示的未修饰的序列或如SEQ ID Nos: 5, 6,7, 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 所示的任一序列。在本专利技术的另一个优选的实施例中，所述正义链可以包含如SEQ ID N0:2所示的序列。此外，在所述正义链的 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 和 / 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的小干扰RNA(siRNA)核苷酸分子，包括正义连和反义链，其中正义链中的至少一个核苷酸或反义链中的至少一个核苷酸是衍生自2，‑0‑胍基丙基(GP)修饰的核苷酸，并且所述核苷酸分子能够沉默靶标序列的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.10.28 ZA 2011/078901.一种修饰的小干扰RNA(SiRNA)核苷酸分子，包括正义连和反义链，其中正义链中的至少一个核苷酸或反义链中的至少一个核苷酸是衍生自2, -O-胍基丙基(GP)修饰的核苷酸，并且所述核苷酸分子能够沉默靶标序列的表达。2.权利要求1所述的核苷酸分子，其中，其中至少一个所述修饰的核苷酸选自由.2-0-胍基丙基腺苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基胞苷亚磷酰胺，2-0-胍基丙基鸟苷亚磷酰胺和.2-0-胍基丙基尿苷亚磷酰胺组成的组或它们的组合。3.权利要求1或2所述的核苷酸分子，所述正义链、反义链的长度分别为18-26个核苷酸。4.权利要求3所述的核苷酸分子，所述正义链、反义链的长度分别为21个核苷酸。5.权利要求1至4任一所述的核苷酸分子，所述正义链、反义链都包括人工合成序列。6.权利要求1至5任一所述的核苷酸分子，所述修饰的SiRNA以病毒的一个互补核苷酸序列为靶标。7.权利要求1至6任一所述的核苷酸分子，其中所述修饰的SiRNA抑制病毒的复制。8.权利要求6或7所述的核苷酸分子，其中所述病毒为肝炎病毒。9.权利要求8所述的核苷酸分子，其中所述病毒是B型肝炎病毒。10.根据权利要求1~9任一所述的核苷酸分子，当转染到培养细胞中时，与未修饰的siRNA相比，其中所述修饰的siRNA不诱发可检测的干扰素反应。11.根据权利要求1~10任一所述的核苷酸分子，其中所述修饰的siRNA比具有相同序列的未修饰的siRNA在标准血清检测中具有更高的稳定性。12.根据权利要求1~11任一所述的核苷酸分子，其中所述修饰的siRNA比具有相同序列的未修饰的siRNA表现出更大的对靶标基因表达的抑制。13.根据权利要求1~12...

【专利技术属性】
技术研发人员：帕特里克·阿巴思诺特，贾斯廷·希恩，阿布杜拉·伊利，穆萨·马里亚尼，约兰塔·布瑞恩斯卡，詹尼弗·多诺费奥，马克西米利安CR·布夫，约阿希姆W·恩格斯，斯蒂芬·贝恩哈特，
申请(专利权)人：约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学，歌德大学，
类型：发明
国别省市：南非;ZA