基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞和方法。本发明专利技术提供的载体包括阻遏蛋白TetR表达载体和含有操纵基因TetO的双向表达载体，在融合前将两者共转染到供体细胞中。筛选阳性转染的细胞，药物诱导表达山羊TET3，将TET3诱导表达的阳性细胞作为最终供体细胞，再将其注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，挑选成功融合的山羊体细胞克隆胚培养。本发明专利技术可以有效的降低供体细胞的甲基化水平，纠正克隆胚胎中的异常高甲基化现象，从而显著提高后期山羊体细胞克隆胚胎的发育率和质量，可以高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎，胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。

Carrier, cell and method for improving cloning efficiency of goat based on modification of DNA methylation level of donor cells

The invention discloses a carrier, cell and method for modifying the cloning efficiency of goat based on the level of DNA methylation of donor cells. The vectors provided by the invention include the repressor TetR expression vector and the bidirectional expression vector containing the operating gene TetO, which are co transfected into the donor cells before fusion. The positive transfected cells were screened, the goat TET3 was induced by drug, and the positive cells induced by TET3 were used as the final donor cells, and then they were injected into the oocytes after the nucleation and were fused to select the successful fusion Goat Somatic cell cloned embryo culture. The invention can effectively reduce the level of methylation of donor cells and correct abnormal hypermethylation in cloned embryos, thus significantly improve the development rate and quality of the cloned goat somatic cloned embryos in the later period, and can efficiently produce goat somatic cloned embryos in vitro. The birth rate of the cloned goat after the embryo transfer is also significant. Improve.

【技术实现步骤摘要】
基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法
本专利技术属于动物体细胞克隆
，涉及一种基于供体细胞甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。
技术介绍
体细胞克隆是一种具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克隆、疾病模型、人器官移植、动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护及优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此技术的广泛应用。目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白乙酰化和DNA甲基化两方面。TET3是一种DNA去甲基化酶，可以降低DNA甲基化的水平，但其酶活性在不同物种中发挥作用的时机并不相同，例如，研究表明，小鼠中敲除TET3基因，导致原核期胚胎中去甲基化作用部分丧失。研究发现，山羊体细胞核移植胚胎甲基化水平异常偏高，降低供体细胞甲基化水平，是提高克隆胚胎发育质量及克隆效率的一种方法，但目前尚未发现一种有效降低体细胞甲基化水平的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，包括用于共转染山羊供体细胞的阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体；所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合或分离调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因。优选的，所述目的基因还包括与山羊TET3基因共表达的EGFP基因。优选的，所述阻遏蛋白表达载体表达四环素阻遏蛋白TetR；所述目的基因诱导表达载体选自含有四环素操纵基因TetO的双向表达载体，且四环素操纵基因TetO对沿两个表达方向排列的目的基因同时进行调控，所述目的基因的序列包括位于其中一个表达方向上的EGFP基因读码框和位于另一个表达方向上的山羊TET3基因读码框。优选的，所述双向表达载体还包括与EGFP基因及山羊TET3基因分别融合表达的Kozak序列。优选的，所述双向表达载体还包括与山羊TET3基因以及对应Kozak序列融合表达的3×FLAG标签序列。优选的，所述阻遏蛋白表达载体选自载体pEF1a-Tet3G；所述目的基因诱导表达载体选自重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI，该重组载体包括骨架载体pTRE3G-BI，并且在该载体的双向启动子两侧的多克隆位点分别插入有EGFP基因和山羊TET3基因，EGFP基因和山羊TET3基因的上游均设置有位于对应多克隆位点内的Kozak序列，山羊TET3基因与其对应的Kozak序列之间设置有3×FLAG标签序列。优选的，所述重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI与载体pEF1a-Tet3G以2～4:1的质量比共转染山羊供体细胞。优选的，所述山羊TET3基因(CDS)的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的细胞，该细胞为过表达山羊TET3基因的山羊核移植供体细胞；所述山羊核移植供体细胞，是以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，利用诱导表达药物对转染于该宿主细胞内的诱导表达系统所携带的目的基因进行诱导表达，并通过筛选得到的目的基因阳性表达细胞；诱导表达系统由上述阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体构成。优选的，所述诱导表达药物为Dox，诱导表达中Dox的处理浓度为100～200ng/mL，处理时间为48～72h；所述阳性表达细胞激发后发出绿色荧光。一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的融合方法，该融合方法包括以下步骤：1)以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将上述阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体共转染至宿主细胞；利用与阻遏蛋白相对应的诱导表达药物对转染成功的宿主细胞进行诱导表达处理，然后将筛选得到的目的基因诱导表达载体的阳性表达细胞作为核移植供体细胞；2)将核移植供体细胞注入到去核后的卵母细胞中后进行电融合，挑选融合细胞进行激活处理，得到克隆胚胎；3)在进行激活处理后于培养液中进行克隆胚培养。优选的，所述共转染具体包括以下步骤：将上述重组载体pTRE3G-GTet3-EGFP-BI和载体pEF1a-Tet3G通过电击转染按2～4:1的质量比共转入山羊原代胎儿成纤维细胞；然后使用400～800μg/mLG418对转染后的细胞进行筛选，得到具有G418抗性的细胞克隆，即转染成功的宿主细胞；优选的，所述诱导表达处理具体包括以下步骤：将具有G418抗性的细胞克隆于含有100～200ng/mLDox的培养液中培养，直至得到在荧光显微镜下呈现绿色的细胞克隆，将该细胞克隆扩大培养至细胞密度达到70～80％后消化并悬浮细胞，然后转接在含有100～200ng/mLDox的培养液中，继续培养48～72h；所述筛选的标准为：保持G418抗性且激发下发出(更强)绿光。所述克隆胚培养具体包括以下步骤：将激活处理后得到的克隆胚胎首先于G1.5培养液中培养72h，然后转移至G2.5培养液中培养至激活处理后第8天。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术基于DNA甲基化水平的修饰来进行表观遗传修饰，利用山羊TET3蛋白的靶向特异性的DNA去甲基化活性，将山羊TET3基因构建于含有阻遏操纵基因(例如TetO)的表达载体中，并将其与对应阻遏蛋白(例如TetR)表达载体共转入核移植供体细胞，这样就可以在核移植前通过药物诱导去阻遏，从而达到供体细胞内DNA去甲基化的表观遗传修饰。通过在核移植前诱导供体细胞表达山羊TET3蛋白，有效降低供体细胞的甲基化水平，并且在核移植后能纠正早期克隆胚胎异常高甲基化状态，从而促进体细胞克隆胚正常发育。且本专利技术显著提高山羊克隆胚的发育率和质量，可高效地体外生产山羊体细胞克隆胚胎；胚胎移植后的克隆山羊的出生率也显著提高。因此，本专利技术能显著提高山羊克隆效率。进一步的，本专利技术利用Dox对山羊胎儿成纤维细胞进行处理，诱导成纤维细胞表达山羊TET3蛋白，可有效降低成纤维细胞的甲基化水平，并且在核移植后能纠正早期克隆胚异常高甲基化状态。与未诱导表达的对照组相比，利用Dox诱导处理之后进行核移植，可显著提高胚胎发育率。Dox诱导处理山羊供体细胞表达TET3蛋白，可有效降低供体细胞DNA的5mC表观遗传修饰水平，核移植后可以显著提高囊胚发育率、囊胚孵化率和囊胚的细胞总数，并且提高山羊的克隆效率。山羊体细胞克隆胚在2细胞期、4细胞期和囊胚期的5mC表观遗传修饰水平显著低于对照组(p<0.05)；山羊体细胞克隆囊胚发育率显著高于对照组(p<0.05)；囊胚的孵化率显著高于对照组(p<0.05)；囊胚的细胞总数显著高于对照组(p<0.05)；山羊的克隆效率得到显著提高(p<0.05)。附图说明图1A为Tet-on3GInducibleExpressionSystem真核细胞诱导表达系统pEF1a-Tet3G载体图谱；TetR阻遏蛋白基因属于图中Tet-on3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：包括用于共转染山羊供体细胞的阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体；所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因。

【技术特征摘要】
1.一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：包括用于共转染山羊供体细胞的阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体；所述目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所述目的基因包括山羊TET3基因。2.根据权利要求1所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述目的基因还包括与山羊TET3基因共表达的EGFP基因。3.根据权利要求1或2所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述阻遏蛋白表达载体表达四环素阻遏蛋白TetR；所述目的基因诱导表达载体选自含有四环素操纵基因TetO的双向表达载体，且四环素操纵基因TetO对沿两个表达方向排列的目的基因同时进行表达调控，所述目的基因的序列包括位于其中一个表达方向上的EGFP基因读码框和位于另一个表达方向上的山羊TET3基因读码框。4.根据权利要求3所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述双向表达载体还包括与EGFP基因及山羊TET3基因分别融合表达的Kozak序列。5.根据权利要求4所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述双向表达载体还包括与山羊TET3基因以及对应Kozak序列融合表达的3×FLAG标签序列。6.根据权利要求1所述一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体，其特征在于：所述山羊TET3基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。7.一种基于供体细胞DNA甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的细胞，其特征在于：该细胞为过表达山羊TET3基因的山羊核移植供体细胞；所述山羊核移植供体细胞，是以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，利用诱导表达药物对转染于该宿主细胞内的诱导表达系统所携带的目的基因进行诱导表达，并通过筛选得到的目的基因阳性表达细胞；诱导表达系统由阻遏蛋白表达载体和目的基因诱导表达载体构成，目的基因诱导表达载体包括目的基因以及通过与阻遏蛋白结合调控目的基因表达的阻遏操纵基因，所携带的目的基因包括山羊TET3基因。8.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涌，刘军，韩成全，苏建民，毛廷超，王勇胜，康健，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61