包含珠蛋白基因簇的调控元件的真核表达载体制造技术

本发明专利技术涉及重组蛋白生产领域。本发明专利技术提供了包含人珠蛋白基因簇的元件的新型表达盒，所述表达盒显示出目标蛋白质或多肽的增强的表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含珠蛋白基因簇的调控元件的真核表达载体
本专利技术涉及可用于增强目标蛋白的生产收率的新型表达盒。该表达盒包含人珠蛋白基因簇的表达调控元件，具体而言包含人Aγ珠蛋白的启动子和人β-珠蛋白或α-珠蛋白基因簇的基因座控制区。本专利技术尤其提供包含这类珠蛋白表达调控元件的表达盒。
技术介绍
重组蛋白生产是当今生物产业的一个主要方面。因为需要大量高品质蛋白质的应用的数目在市场上增加，所以重组蛋白生产越来越重要。食品生产以及尤其是药理学是对重组蛋白的需求稳步增加的两个主要领域。为了获得商业上可行的工艺，需要更高的生产效率以及因此导致的更低的最终产品费用。然而，同时高的产品品质以及与人类应用的相容性是必须的。越来越多的应用需要在真核细胞，尤其是在高等真核细胞中重组生产蛋白质。特别是，携带翻译后修饰诸如糖基化的蛋白质(糖蛋白)在原核细胞系统诸如大肠杆菌或真核细胞系统诸如(尤其是人细胞系)中表达时显著不同。这些差异在许多情形中明显影响所产生的蛋白质的生物活性以及免疫原性。然而，使用高等真核细胞系的许多表达系统的缺点是所需蛋白质的表达率相当低，从而导致重组蛋白的收率低且费用高。因此，本领域需要提供新型的手段和方法，用于增加重组蛋白生产的收率，尤其是在使用真核表达细胞系时。
技术实现思路
如本专利技术所展示的，可组合人珠蛋白基因簇的某些元件来提供表达盒，该表达盒使得目标多肽能在真核细胞中稳定高效表达。具体地讲，β-珠蛋白基因簇或α-珠蛋白基因簇的基因座控制区的特定部分与Aγ珠蛋白启动子以及任选的还有Aγ珠蛋白3'增强子的组合可形成具有惊人的高且稳定的表达率的表达盒。因此，本专利技术在第一个方面提供用于重组生产目标多肽的方法，包括以下步骤：(a)提供宿主细胞，该宿主细胞包含表达盒，所述表达盒包含功能上彼此连接的以下元件：(i)包含人β-珠蛋白基因簇或人α-珠蛋白基因簇的基因座控制区的至少功能部分的基因座控制区；(ii)包含人Aγ珠蛋白基因的启动子的至少功能部分的启动子区；以及(iii)包含编码目标多肽的核酸序列的编码区；(b)在宿主细胞表达目标多肽的条件下培养宿主细胞；以及(c)分离所述目标多肽。在第二个方面，本专利技术提供包含在功能上彼此连接的以下元件的表达盒：(i)包含人β-珠蛋白基因簇或人α-珠蛋白基因簇的基因座控制区的至少功能部分的基因座控制区；(ii)包含人Aγ珠蛋白基因的启动子的至少功能部分的启动子区；(iii)任选地编码区；(iv)转录终止子区；以及(v)包含人Aγ珠蛋白基因的3'增强子的至少功能部分的增强子区；其中该表达盒不包含编码整个人Aγ珠蛋白的核酸序列。在第三个方面，本专利技术提供包含根据第二个方面的表达盒的载体以及包含所述表达盒或所述载体的宿主细胞。根据下面的描述以及随附的权利要求书，本专利技术的其他目标、特征、优点和方面对本领域技术人员将显而易见。然而，应当理解，下面的描述、随附的权利要求书以及表明本申请优选实施方案的具体实施例仅以示例方式给出。通过阅读下文，在本公开专利技术的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。定义如本文所用，下面的表述总体上优选具有下面列出的含义，除非使用它们的上下文另外明确指明。如本文所用，表述“包含”除了其字面含义以外还包括并且尤其是指表述“基本上由...组成”和“由...组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的元件的主题不包含另外的元件的实施方案以及其中“包含”具体列出的元件的主题可以和/或确实涵盖另外的元件的实施方案。同样，表述“具有”应该理解为表述“包含”，还包括并且尤其包括表述“基本上由...组成”和“由...组成”。本文所用的术语“核酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸聚合物。核酸可以是RNA或DNA。其可以由单条聚合物链构成或者其可以是双链。核酸可以是天然来源的、重组来源的或合成来源的。在优选的实施方案中，核酸是双链DNA。“表达盒”是一种生成的或者合成的核酸构建体，其中具有能够实现结构基因在与这类序列相容的宿主中表达的核酸元件。表达盒至少包含启动子和任选地转录终止信号。典型的，表达盒包含待转录的核酸和启动子。有助于实现表达的另外的因子也可如本文所述使用。例如，表达盒还可包含编码引导表达的蛋白质从宿主细胞分泌的信号序列的核苷酸序列。表达盒优选是表达载体的一部分。将要用于表达待转录的核酸的宿主细胞用该表达载体转化或转染。为了允许对包含该构建体的转化细胞进行选择，可将选择标记基因便利地包括在表达载体中。本领域技术人员将认识到可对该载体组分进行修改而不会实质影响其功能。表述“功能上相连”意指表达盒的两个或更多个元件以它们的功能能够相协调并允许编码序列(如编码区)表达的方式彼此相连。举个例子，当启动子能够确保编码序列表达时，则该启动子与所述编码序列功能上相连。根据本专利技术的表达盒的构建以及其各种元件的组装可使用本领域技术人员所熟知的技术，尤其是在Sambrook等人(1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual，NolanC.编辑，NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress)中描述的那些技术来进行。本文所用的术语“上游”和“下游”是指核酸分子上的核酸元件或序列相对于所述核酸分子上的另一核酸元件或序列的位置。“上游”是指更接近核酸分子的5'端的位置，而“下游”是指更接近核酸分子的3'端的位置。在双链核酸，尤其是DNA的情形中，核酸中用作基质来转录RNA诸如mRNA的那条链，即有义链，用来确定该核酸的5'端和3'端。因此，“上游”是在有义链的5'端的方向，而“下游”是在有义链的3'端的方向。靶标核酸序列或氨基酸序列的“同源物”与所述靶标核酸序列或氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性。氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”优选根据本专利技术在靶标序列的整个长度上或在靶标序列的所标明部分的整个长度上确定。当提及具体的核酸序列或氨基酸序列时，本专利技术通常还分别涵盖所述核酸序列或氨基酸序列的同源物。靶标核酸序列或氨基酸序列的同源物尤其是具有衍生其的靶标核酸序列或氨基酸序列的相同或基本相同的功能和活性的功能同源物。“启动子”是允许和控制与其功能上相连的核酸序列，尤其是编码序列的转录的核酸序列。启动子含有用于结合RNA聚合酶的识别序列，并且包含转录起始位点或与转录起始位点功能上相连。启动子可以是诱导型启动子，其仅在存在(或缺少)特定信号的情况下有活性，或者可以是组成活性启动子。启动子的活性可进一步通过调控元件诸如基因座控制区和增强子元件调控。“编码序列”是编码基因产物诸如多肽或RNA的核酸序列。核酸元件的“部分”尤其包含所述核酸元件的至少5个核酸，优选至少10个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个核酸。核酸元件的“部分”尤其包含所述核酸元件的至少5个连续核苷酸，优选至少10个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续核苷酸。具体地讲，其包含所述核酸元件的至少1％，优选至少2％、至少3％、至少5％、至少7.5％、至少10％、至少15％、至少20％或至少25％。核酸元件的“功本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于重组生产目标多肽的方法，包括以下步骤：(a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含表达盒，所述表达盒包含功能上彼此相连的以下元件：(i)包含人β‑珠蛋白基因簇或人α‑珠蛋白基因簇的基因座控制区的至少功能部分的基因座控制区；(ii)包含人

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.31 EP 15161922.8;2015.03.31 LU 926861.一种用于重组生产目标多肽的方法，包括以下步骤：(a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含表达盒，所述表达盒包含功能上彼此相连的以下元件：(i)包含人β-珠蛋白基因簇或人α-珠蛋白基因簇的基因座控制区的至少功能部分的基因座控制区；(ii)包含人Aγ珠蛋白基因的启动子的至少功能部分或其同源物的启动子区；以及(iii)包含编码所述目标多肽的核酸序列的编码区；(b)在所述宿主细胞表达所述目标多肽的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)分离所述目标多肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达盒的所述编码区还包含编码用于分泌表达的信号肽的核酸序列，并且其中在步骤(b)中所述目标多肽由所述宿主细胞分泌。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(c)后还包括以下步骤(d)将所述目标多肽配制为药物组合物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述表达盒的所述基因座控制区包含人β-珠蛋白基因簇的DNA酶I超敏感位点2(HS2)的核心元件，优选具有SEQIDNO:1中位置906至939的核酸序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表达盒的所述基因座控制区包含人β-珠蛋白基因簇的DNA酶I超敏感位点2(HS2)的M1-核心-M2元件，优选具有SEQIDNO:1中位置742至995的核酸序列。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述表达盒的所述基因座控制区包含人β-珠蛋白基因簇的超敏感位点2(HS2)的至少一部分，所述部分包含SEQIDNO:1中位置741至1109的核酸序列。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述表达盒的所述基因座控制区还包含人β-珠蛋白基因簇的超敏感位点3(HS3)或其部分，优选具有SEQIDNO:1中位置310至735的核酸序列，和/或人β-珠蛋白基因簇的超敏感位点4(HS4)或其部分，优选具有SEQIDNO:1中位置13至294的核酸序列。8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述表达盒的所述基因座控制区包含人α-珠蛋白基因簇的超敏感位点40(HS40)或其部分，优选具有SEQIDNO:5中位置24至278的核酸序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述表达盒的所述启动子区包含转录起始位点以及任选地人Aγ珠蛋白基因的5'非翻译区的至少一部分。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述表达盒的所述启动子区包含人Aγ珠蛋白基因中相对于转录起始位点而言的核苷酸-384至+36，以及/或者SEQIDNO:1中位置1123至1542的核酸序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述表达盒还包含转录终止子区。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述转录终止子区包含多聚腺苷酸化信号，优选包含SEQIDNO:1中位置1725至1730的核酸序列，以及转录终止位点。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述表达盒还包含增强子区，所述增强子区包含与所述表达盒的其它元件在功能上连接的人Aγ珠蛋白基因的3'增强子的至少功能部分。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述表达盒的所述增强子区包含SEQIDNO:1中位置2136至2881的核酸序列。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述目标多肽是糖蛋白或其部分。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述目标多肽选自：抗体或其衍生物或部分，包括抗体的重链或轻链；促性腺激素诸如FSH(促卵泡激素)、CG(绒毛膜促性腺激素)、LH(促黄体生成激素)和TSH(促甲状腺激素)；红细胞生成素；和血液凝固因子诸如因子VII、VIII、IX或冯维勒布兰德因子。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中将所述表达盒稳定转染进所述宿主细胞中。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中用包含所述表达盒和选择标记基因(优选可扩增选择标记基因)的载体转染所述宿主细胞，并且其中步骤(b)中的培养条件包括在细胞培养基中存在对应的选择剂。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述选择标记基因编码二氢叶酸还原酶(DHFR)，优选抗叶酸剂抗性DHFR变体，并且对应的选择剂为抗叶酸剂，优选甲氨喋呤。20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选人细胞，或者源自它们的细胞。21.根据权利要求1至20中任...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·戈勒兹，D·雅恩，A·丹尼尔奇克，
申请(专利权)人：葛莱高托普有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE