一种确定ATR与ERK结合区域的方法技术

本发明专利技术涉及一种确定ATR与ERK结合区域的方法，本发明专利技术的有益效果在于：本发明专利技术提供的确定ATR与ERK结合区域的方法中，通过重组质粒转染细胞，并采用免疫共沉淀的方法，确定ERK激酶与ATR蛋白的作用区域，有利于进一步确定这些作用区域在DDR中的功能，从而为进一步阐明ERK激酶在DDR反应中的具体作用机制打下基础，对进一步理解肿瘤的发生、抗肿瘤药物的作用机制、合理用药及寻找新的作用靶点具有重要的理论意义和实用价值。

A method for determining the area of ATR and ERK

The invention relates to a method for determining the binding area of ATR and ERK. The beneficial effect of the invention is that in the method provided by the invention to determine the binding region of ATR and ERK, the recombinant plasmid is transfected to the cells, and the immunoprecipitation method is used to determine the region of the ERK kinase and the ATR protein, which is beneficial for further determination of these The function of the action region in DDR can lay the foundation for further clarifying the specific mechanism of ERK kinase in the DDR reaction, and is of great theoretical and practical value for further understanding of the occurrence of tumor, the mechanism of antitumor drugs, rational use of drugs and finding new targets.

【技术实现步骤摘要】
一种确定ATR与ERK结合区域的方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种确定ATR与ERK结合区域的方法。
技术介绍
DNA损伤反应(DDR)是真核细胞维护遗传信息传递的准确性和完整性的重要调控机制，是人体抵御恶性肿瘤的重要防御机制。当DDR发生时，ATM、ATR等蛋白激酶激活并使多种DNA损伤检控蛋白磷酸化从而启动一系列信号传递通路。本课题组最近研究发现ERK激酶在ATM与ATR反应的DNA损伤通路中起到重要的调节作用，免疫共沉淀结果发现ERK激酶与ATR蛋白存在结合区域，但具体的调控机制与结合位点尚未明确。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种确定ATR与ERK结合区域的方法，解决ERK激酶与ATR蛋白之间的结合区域尚未明确的问题。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种确定ATR与ERK结合区域的方法，包括以下步骤：S1：采用HA标记ERK；S2：采用Flag标记ATR；S3：以HA标记的ERK和Flag标记的ATR构建第一重组质粒；S4：将构建的第一重组质粒转染至293T细胞；S5：使用HA和Flag标签的抗体对转染第一重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到第一ATR-ATRIP复合体，并使用westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S6：根据westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶中的激酶区域或非激酶区域与ATR-ATRIP复合体是否存在结合区域；S7：若ERK激酶与ATR-ATRIP复合体存在结合区域，则定位ERK激酶与ATR中的结合域；S71：以敲除N端的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第二重组质粒；S72：以敲除FAT序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第三重组质粒；S73：以敲除激酶区域的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第四重组质粒；S74：以敲除FATC序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第五重组质粒；S8：分别将第二重组质粒、第三重组质粒、第四重组质粒、第五重组质粒转染至293T细胞；S9：使用HA和Flag标签的抗体分别对转染第二重组质粒后的293T细胞、转染第三重组质粒后的293T细胞、转染第四重组质粒后的293T细胞、转染第五重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到相应的第二ATR-ATRIP复合体、第三ATR-ATRIP复合体、第四ATR-ATRIP复合体、第五ATR-ATRIP复合体，并使用westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S10：根据westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶与相应的第二ATR-ATRIP复合体、第三ATR-ATRIP复合体、第四ATR-ATRIP复合体或第五ATR-ATRIP复合体是否存在结合区域；S11：若ERK与上述ATR-ATRIP结合区域第二ATR-ATRIP复合体、第三ATR-ATRIP复合体、第四ATR-ATRIP复合体或第五ATR-ATRIP复合体中其中一个复合体存在结合区域，则可确定ATR-与ERK的结合区域。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的确定ATR与ERK结合区域的方法中，通过重组质粒转染细胞，并采用免疫共沉淀的方法，确定ERK激酶与ATR蛋白的作用区域，有利于进一步确定这些作用区域在DDR中的功能，从而为进一步阐明ERK激酶在DDR反应中的具体作用机制打下基础，对进一步理解肿瘤的发生、抗肿瘤药物的作用机制、合理用药及寻找新的作用靶点具有重要的理论意义和实用价值。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。本专利技术最关键的构思在于：本专利技术通过重组质粒转染细胞，并采用免疫共沉淀的方法，确定ERK激酶与ATR蛋白的作用区域。本专利技术涉及一种确定ATR与ERK结合区域的方法，包括以下步骤：S1：采用HA标记ERK；S2：采用Flag标记ATR，所述ATR包括ATR-kd；S3：以HA标记的ERK和Flag标记的ATR构建第一重组质粒；S4：将构建的第一重组质粒转染至293T细胞；S5：使用HA和Flag标签的抗体对转染第一重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到第一ATR-ATRIP复合体，并使用westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S6：根据westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶与ATR-ATRIP复合体是否存在结合区域；S7：若ERK激酶与ATR-ATRIP复合体存在结合区域，则定位ERK激酶与ATR中的结合域；S71：以敲除N端的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第二重组质粒；S72：以敲除FAT序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第三重组质粒；S73：以敲除激酶区域的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第四重组质粒；S74：以敲除FATC序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第五重组质粒；S8：分别将第二重组质粒、第三重组质粒、第四重组质粒、第五重组质粒转染至293T细胞；S9：使用HA和Flag标签的抗体分别对转染第二重组质粒后的293T细胞、转染第三重组质粒后的293T细胞、转染第四重组质粒后的293T细胞、转染第五重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到相应的第二ATR-ATRIP复合体、第三ATR-ATRIP复合体、第四ATR-ATRIP复合体、第五ATR-ATRIP复合体，并使用westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S10：根据westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶与相应的第二ATR-ATRIP复合体、第三ATR-ATRIP复合体、第四ATR-ATRIP复合体或第五ATR-ATRIP复合体是否存在结合区域；S11：若ERK与上述ATR-ATRIP结合区域第二ATR-ATRIP复合体、第三ATR-ATRIP复合体、第四ATR-ATRIP复合体或第五ATR-ATRIP复合体中其中一个复合体存在结合区域，则可确定ATR-与ERK的结合区域。上述确定ATR与ERK结合区域的方法的有益效果在于：本专利技术通过重组质粒转染细胞，并采用免疫共沉淀的方法，确定ERK激酶与ATR蛋白的作用区域，有利于进一步确定这些作用区域在DDR中的功能，从而为进一步阐明ERK激酶在DDR反应中的具体作用机制打下基础，对进一步理解肿瘤的发生、抗肿瘤药物的作用机制、合理用药及寻找新的作用靶点具有重要的理论意义和实用价值。进一步的，上述确定ATR与ERK结合区域的方法中，所述S11后，还包括步骤：根据ATR与ERK的结合区域，进一步确定该ATR与ERK的相互作用位点。进一步的，上述确定ATR与ERK结合区域的方法中，所述S1具体为：S1：采用HA标记ERK，所述ERK包括ERK1/2和ERK1/2-kd。进一步的，上述确定ATR与ERK结合区域的方法中，所述S2具体为：S2：采用Flag标记ATR，所述ATR包括ATR-kd。进一步的，上述确定ATR与ERK结合区域的方法中，所述S6具体为：S6：根据westernb本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定ATR与ERK结合区域的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：采用HA标记ERK；S2：采用Flag标记ATR；S3：以HA标记的ERK和Flag标记的ATR构建第一重组质粒；S4：将构建的第一重组质粒转染至293T细胞；S5：使用HA和Flag标签的抗体对转染第一重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到第一ATR‑ATRIP复合体，并使用western blotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S6：根据western blotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶与ATR‑ATRIP复合体是否存在结合区域；S7：若ERK激酶与ATR‑ATRIP复合体存在结合区域，则定位ERK激酶与ATR中的结合域；S71：以敲除N端的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第二重组质粒；S72：以敲除FAT序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第三重组质粒；S73：以敲除激酶区域的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第四重组质粒；S74：以敲除FATC序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第五重组质粒；S8：分别将第二重组质粒、第三重组质粒、第四重组质粒、第五重组质粒转染至293T细胞；S9：使用HA和Flag标签的抗体分别对转染第二重组质粒后的293T细胞、转染第三重组质粒后的293T细胞、转染第四重组质粒后的293T细胞、转染第五重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到相应的第二ATR‑ATRIP复合体、第三ATR‑ATRIP复合体、第四ATR‑ATRIP复合体、第五ATR‑ATRIP复合体，并使用western blotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S10：根据western blotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶与相应的第二ATR‑ATRIP复合体、第三ATR‑ATRIP复合体、第四ATR‑ATRIP复合体或第五ATR‑ATRIP复合体是否存在结合区域；S11：若ERK与上述ATR‑ATRIP结合区域第二ATR‑ATRIP复合体、第三ATR‑ATRIP复合体、第四ATR‑ATRIP复合体或第五ATR‑ATRIP复合体中其中一个复合体存在结合区域，则可确定ATR‑与ERK的结合区域。...

【技术特征摘要】
1.一种确定ATR与ERK结合区域的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：采用HA标记ERK；S2：采用Flag标记ATR；S3：以HA标记的ERK和Flag标记的ATR构建第一重组质粒；S4：将构建的第一重组质粒转染至293T细胞；S5：使用HA和Flag标签的抗体对转染第一重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到第一ATR-ATRIP复合体，并使用westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果；S6：根据westernblotting实验检测免疫共沉淀实验结果，判断ERK激酶与ATR-ATRIP复合体是否存在结合区域；S7：若ERK激酶与ATR-ATRIP复合体存在结合区域，则定位ERK激酶与ATR中的结合域；S71：以敲除N端的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第二重组质粒；S72：以敲除FAT序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第三重组质粒；S73：以敲除激酶区域的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第四重组质粒；S74：以敲除FATC序列的ATR以Flag标记后，和以HA标记的ERK构建第五重组质粒；S8：分别将第二重组质粒、第三重组质粒、第四重组质粒、第五重组质粒转染至293T细胞；S9：使用HA和Flag标签的抗体分别对转染第二重组质粒后的293T细胞、转染第三重组质粒后的293T细胞、转染第四重组质粒后的293T细胞、转染第五重组质粒后的293T细胞进行免疫共沉淀实验，得到相应的第二ATR-ATRIP复合体、第三AT...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏凤香，唐大木，何立智，万新红，裴元元，温丽娟，宿宁，尹爱华，
申请(专利权)人：深圳市龙岗区妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：广东,44