利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法技术

本发明专利技术提供一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN‑β启动子活性的方法，包括以下步骤：A、构建含鸭IFN‑β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；B、将含鸭IFN‑β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染目标细胞；所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；C、将转染后的目标细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN‑β启动子活性。该方法操作简单易行，通量高，且具有较高的可重复性和准确度，为研究鸭IFN‑β通路提供了有效的检测工具。

Detection of duck IFN- beta promoter activity by dual luciferase reporter gene

The present invention provides a method for detecting the activity of the duck IFN promoter beta promoter using a double luciferase reporter gene, including the following steps: A, the construction of a firefly luciferase recombinant plasmid containing the sequence of the duck IFN beta promoter target, and B, the recombinant plasmid of fluorescein luciferase, which contains the sequence of the duck IFN beta promoter target, and the stimulator, and the internal parameter. The target cells were transfected with the premixed granules and liposomes, and the reference plasmid was the luciferase plasmid of the sea cucumber. C, the target cells after the transfection were cultured and lysate to detect the activity of luciferase, that is, the activity of the duck IFN beta promoter was obtained. The method is simple, easy to operate, high fluxes, and has high repeatability and accuracy. It provides an effective tool for the study of duck IFN - beta pathway.

【技术实现步骤摘要】
利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法
本专利技术涉及分子遗传学及细胞生物
，具体涉及一种双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法。
技术介绍
鸭是主要的家禽养殖物种，近年来受高致病性禽流感的影响，给养殖户带来巨大的损失，同时对公共安全也产生了严重的威胁。干扰素(Interferon，IFN)具有抗病毒、抗肿瘤活性及强大的免疫调节作用，对于禽类的先天性免疫及触发适应性免疫十分重要。根据IFN氨基酸序列和其特异性识别受体的不同，将IFN分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，β干扰素(IFN-β)属于Ⅰ型IFN。IFN-β是由微生物、dsRNA和病毒等干扰素诱生剂刺激细胞后所产生的高活性多功能蛋白，抗病毒活性强，具有广谱的抑制病毒、抗肿瘤、调节免疫力和激素刺激等生物学活性，在细胞因子基础和临床研究中具有重要价值。目前为止，由于IFN-β具有很强的疏水性，一直没有可靠稳定的色谱方法对其进行准确定量分析。当前IFN活性检测方法主要有：抗病毒活性检测方法，常用水泡性口炎病毒(VSV)进行检测，但该方法敏感性和准确率较低，且具有一定生物安全危险性；ELISA检测方法，检测方便快捷，但局限于检测IFN的抗原性，且不同IFN需要不同的单抗，通用性低；荧光定量PCR检测方法，该方法是在提取宿主细胞mRNA的基础上进行，但RNA极不稳定，对检测结果的准确性有一定影响。因此建立一种适用范围广，精确率高的检测方法对IFN的研究具有重要意义。启动子是真核基因转录起始位点上游一段长度不等的特异性序列，该片段有多种调节因子的结合位点，能顺式调控基因的转录。因此可以通过检测启动子的激活程度间接定量IFN-β的表达量。双荧光素酶报告基因检测系统具有检测快速、灵敏度高、线性范围广且在大多数哺乳动物细胞无内源性表达等诸多优点。本方法将鸭IFN-β的启动子片段插入带有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒，若启动子被激活，则其下游的萤火虫荧光素酶表达，通过对荧光素酶的检测来确定目的基因的表达情况。该检测方法的建立，为后续鸭先天性免疫信号通路的研究提供了有效的工具。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法。本专利技术充分利用双荧光素酶报告基因检测系统，将鸭IFN-β启动子插入萤火虫荧光素酶报告质粒，通过检测荧光素酶的表达量表征启动子的激活情况，从而达到对IFN-β表达量的检测，是一种便捷快速、灵敏性高且重复性好的鸭IFN-β检测方法。该检测方法的建立，为后续鸭先天性免疫信号通路的研究提供了有效的工具。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；B、将含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染鸭胚成纤维细胞DEF,所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；C、将转染后的DEF细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN-β启动子活性。优选地，步骤A的构建方法包括以下步骤：将鸭IFN-β启动子靶序列连接至萤火虫荧光素酶报告质粒上，从而构建了含鸭IFN-β启动子不同区域的萤火虫荧光素酶重组质粒。优选地，所述鸭IFN-β靶序列选自IFN-β启动子区域-1530位和-390位至第一外显子+63位形成的2个片段中的任意一个片段序列。优选地，获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的引物包括：上游引物，SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的序列中的任意一个序列；下游引物，SEQIDNo.3所示的序列。3条引物分别为：上游引物P1(SEQIDNo.1)：CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCATTGCACAAAGTATAATC；上游引物P2(SEQIDNo.2)：CGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCTAAAACACTTCTGCAGC；通用下游引物(SEQIDNo.3)：GCTTACTTAGATCGCAGATCTCATGGTGGCTCTTGGGTTG。优选地，获得所述鸭IFN-β启动子靶序列采用的PCR扩增的反应条件为：变性98℃10s、退火58℃15s、延伸68℃1min，30个循环，终延伸68℃5min。优选地，步骤B中，所述刺激物包括RIG-I、poly(I:C)或dsDNA中的至少一种。优选地，步骤B中，所述转染细胞采用的脂质体的转染量为1μL/孔。优选地，步骤C中，所述培养时间为20小时。优选地，所述转染前将生长状态良好的DEF细胞以每孔2×105个细胞密度接种于24孔板，待细胞单层长至密度约为90％时进行质粒转染；转染时将培养基更换为10％FBS的DMEM(无双抗)，每孔400μL，用DMEM将脂质体及萤火虫荧光素酶重组质粒、刺激物预混至100μL，常温孵育20分钟后均匀滴加入每孔。转染6小时后换为10％FBS的DMEM(无双抗)，于转染后20小时测荧光。启动子是真核基因转录起始位点上游一段长度不等的特异性序列，该片段有多种调节因子的结合位点，能顺式调控基因的转录。因此可以通过检测启动子的激活程度间接定量IFN-β的表达量。双荧光素酶报告基因检测系统具有检测快速、灵敏度高、线性范围广且在大多数哺乳动物细胞无内源性表达等诸多优点。本方法将鸭IFN-β的启动子片段插入带有萤火虫荧光素酶基因的报告质粒上，若启动子被激活，则其下游的荧光素酶表达，通过对荧光素酶的检测来确定目的基因的表达情况。该检测方法的建立，为后续鸭先天性免疫信号通路的研究提供了有效的工具。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1.本专利技术将包含鸭IFN-β启动子1530bp，第一外显子63bp的片段连接至萤火虫荧光素酶报告质粒构建了pGL-IFN-β-1593重组质粒，与不同刺激物共转染DEF，荧光素酶的表达量均显著，且在不同的刺激物下表达量不同，表明可以利用此重组质粒定量检测在不同条件、不同刺激下对IFN-β表达水平的影响。2.本专利技术将鸭IFN-β启动子截短至-390位至+63位的片段连接至萤火虫荧光素酶报告质粒构建了pGL-IFN-β-453重组质粒，结果显示与全长构建的pGL-IFN-β-1593重组质粒具有相同检测活性，因此在后续研究中可运用该截短片段构建的重组质粒检测IFN-β的表达水平，不仅可以达到较高的准确率，同时还可降低整个重组质粒的碱基数，除去冗余碱基的影响。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本专利技术所述的萤火虫荧光素酶重组质粒的构建图；图2为本专利技术中2个不同长度的鸭IFN-β启动子片段PCR产物的电泳示意图；图3为本专利技术中确认最佳脂质体转染量的细胞显微镜图；其中，左侧第一列为10倍物镜下蓝色光激发的绿色荧光视野，发光斑块代表荧光蛋白在细胞内表达，第二列为同一视野下的白光；第三列为20倍物镜下蓝色光激发的绿色荧光视野，第四列为同一视野下的白光；第一排至第四排分别是脂质体转染量为0.5μL/孔、1μL/孔、2μL/孔以及4μL/孔；图4为本专利技术中构建的2个含靶片段的萤火虫荧光素酶重组质粒在过表达免疫分子RIG-I、双链R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN‑β启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建含鸭IFN‑β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；B、将含鸭IFN‑β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染鸭胚成纤维细胞DEF,所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；C、将转染后的DEF细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN‑β启动子活性。

【技术特征摘要】
1.一种利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒；B、将含鸭IFN-β启动子靶序列的萤火虫荧光素酶重组质粒与刺激物、内参质粒及脂质体预混后转染鸭胚成纤维细胞DEF,所述内参质粒为海参荧光素酶质粒；C、将转染后的DEF细胞进行培养后裂解，检测荧光素酶活性，即得鸭IFN-β启动子活性。2.根据权利要求1所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，步骤A的构建方法包括以下步骤：将鸭IFN-β启动子靶序列连接至萤火虫荧光素酶报告质粒上，从而构建了含鸭IFN-β启动子不同区域的萤火虫荧光素酶重组质粒。3.根据权利要求2所述的利用双荧光素酶报告基因检测鸭IFN-β启动子活性的方法，其特征在于，所述鸭IFN-β靶序列选自IFN-β启动子区域-1530位和-390位至第一外显子+63位形成的2个片段中的任意一个片段序列。4.根据权利要求1或2或3所述的利用双荧光素酶报告基因检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建和，刘云霞，程玉强，严亚贤，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31