人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用技术

本发明专利技术公开了一种人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用。本发明专利技术首次通过定点基因敲入人突变的亨廷顿外显子基因，且首次利用CRISPR/Cas9技术定点敲入致病基因，通过优化sgRNA，优化供体载体，提高了基因敲入阳性克隆细胞的概率，与猪体细胞核移植技术结合提高了直接获得阳性的基因敲入猪的概率，获得了人亨廷顿疾病基因敲入的小型猪，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。本发明专利技术构建的亨廷顿基因敲入模型猪可产生典型的呼吸障碍、运动障碍等与人类亨廷顿疾病相类似的行为学特征并能进行稳定的可遗传的传代，为人类研究亨廷顿疾病提供可靠的模型，并能够确保数量以能用于药物筛选，以及基因治疗干细胞治疗等，可以成为人类良好的疾病模型。

Human Huntington gene knock in recombinant vector and its construction method and its application in construction of model pig

The invention discloses a recombinant vector for human Huntington gene knock in and its construction method and its application in constructing the model pig. This invention is the first time to knock the mutant Huntington exons gene into the human exon gene through a fixed point gene, and first use the CRISPR/Cas9 technique to knock into the pathogenic gene, optimize the sgRNA, optimize the donor carrier, improve the probability of the gene knock into the positive clones, and improve the direct positive base by combining with the porcine cell nuclear transfer technology. Because of the probability of being knocked into pigs, a miniature pig knocked out by human Huntington disease gene was obtained, demonstrating the feasibility of this method for constructing genetically modified pigs. The Huntington gene, constructed by the invention, can produce typical behavioural characteristics similar to human Huntington disease, such as respiratory disorder and dyskinesia, and can carry out stable and hereditary passages, provide a reliable model for human study of Huntington's disease, and ensure that the number can be used for drug screening, and Gene therapy, stem cell therapy and so on, can become a good human disease model.

【技术实现步骤摘要】
人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用。
技术介绍
亨廷顿疾病(HutingtonDiseases，HD)是由携带大于37个多聚谷氨酸重复的N末端片段在核内形成包涵体和神经纤维的聚集所产生的(Gusellaetal.,Archivesofneurology,1993；Vonsatteletal.,Journalofneuropathologyandexperimentalneurology1998)，由位于第四号染色体短臂上的亨廷顿基因(Huntingtin,Htt)发生突变所导致的常染色体显性遗传病，主要表现为变异蛋白在脑神经细胞内累积并造成神经细胞死亡。亨廷顿疾病的发病原因十分清晰，当HTT基因含有37个以上的谷氨酰胺序列时，突变的亨廷顿蛋白便发生错误折叠，在神经元内形成包涵体聚集导致神经元死亡，从而使人产生运动和认知功能障碍。由于直接对病人进行实验往往受到实验材料及伦理方面的限制，所以制作一个与人类生理功能基本相似的亨廷顿疾病模型，对研究人类亨廷顿及其他神经退行性疾病具有重要的意义，有助于揭示由聚集物和错误折叠蛋白所产生的包涵体形成的机制。现阶段的亨廷顿疾病动物模型主要为果蝇、斑马鱼、小鼠和大鼠等小动物模型，无法真实地反应人类亨廷顿疾病的症状。与这些动物模型相比，猪在进化上与人类更为接近，例如神经、消化系统、皮肤、骨骼发育以及代谢等极其相似于人相比于大鼠、小鼠的无脑沟和脑回；猪的大脑结构有脑沟和脑回，且容量等与人类大脑非常相似；并且猪的基因表达、疾病的发生发展更与人类相似。因此，猪可以作为一种理想的亨廷顿疾病动物模型。转入变异Huntintin基因的猪中，新生小猪与正常猪比较往往很弱小而且体重增加缓慢，在出生后不久便发生死亡，因此不能很好的模拟人在中年后才发病的神经退行性疾病的症状。经过分析，这是由于基因的多拷贝整合或Huntintin变异蛋白的过度表达导致大动物出生后的立即死亡。传统基因敲入模型常利用小鼠干细胞同源重组的方法获得，而该传统方法用于猪成纤维细胞所获得基因敲入的概率非常低，只有10-6而且周期长至6个月到一年。而利用诱导多潜能干细胞(ips)进行基因敲除或敲入仍然存在技术上的难题，通常，耗时、耗力并且价格昂贵。近年来，人工核酸内切酶(Engineeredendonuclease，EEN)技术的出现使得大动物基因打靶发生了翻天覆地的变化。人工核酸酶可以通过在DNA靶位点产生DNA双链断裂(Doublestrandbreaks，DSBs)，该DSBs可以激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologousend-ing-joining，NHEJ)或同源重组修复(Homology-DirectedRepair，HDR)两种不同的修复机制对损伤的DNA进行修复，从而实现对基因组的定点编辑。有效的人工核酸酶包括锌指核酸酶(ZFNs)，可以将敲除效率提高至4％，然而面对基因敲入效率仍然难以实现。转录激活样效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs)使基因敲除效率进一步提高，然而，构建长的TALE重复序列是一个耗时耗力的过程。Cas9核酸内切酶来源于细菌的CRISPR/Cas9系统，RNA介导的CRISPR-相关的Cas9酶可以通过特定的20碱基对靶向序列进行识别剪切。2013年初，MIT的FengZhang研究组首次报道利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞的Th基因实现了定点突变(Congetal.,Science,2013)。将编码Cas9的mRNA和特定sgRNA注射到单细胞斑马鱼胚胎内，10个切割位点中有8个位点都发生了切割(Hruschaetal.,Development,2013)，且其效果远远地高于TALEN，将Cas9RNA和sgRNA注射入胚胎中并未检测到其毒性。因此，利用Cas9技术来进行基因打靶基因修饰是一种高效、方便、快捷的手段。目前Cas9技术已经广泛地应用于小鼠细胞、小鼠(Shenetal.,CellRes,2013；Wangetal.,Cell,2013)、大鼠(Maetal.,CellRes,2014)、人类多种细胞系等动物中，并且通过技术改善得到了非常低的脱靶效率。Tang等通过将Cas9mRNA和sgRNA注入到受精卵的胞质中，直接获得敲除vWF基因猪的血友病模型(Haietal.,CellRes,2014)。Zhou等利用Cas9通过体细胞核移植的方式通过敲除版纳小型猪(黑色的)上的酪氨酸酶TYR-/-成功的获得了白化病模型的并且没有嵌合的模型猪，通过PARK2-/-/PINK1-/-双敲除基因猪获得了帕金森疾病模型猪(Zhouetal.,CellMolLifeSci,2015)。尽管利用Cas9可以产生很高的基因敲除效率，然而直接将Cas9、sgRNA、重组载体注入到受精卵中生产基因敲入动物的效率远远低于基因敲除的效率。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种基因敲入效率高并可稳定传代的人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用。一种人亨廷顿基因敲入用的重组载体，所述重组载体中插入有敲入片段，所述敲入片段包括人突变的亨廷顿基因片段以及分别位于所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游的与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段。在其中一个实施例中，所述人突变的亨廷顿基因片段中的CAG重复序列的数量超过36个，优选为150个，更优选人突变的亨廷顿基因片段的序列如SEQIDNo.13所示。一种重组载体的构建方法，包括如下步骤：构建含有人突变的亨廷顿基因片段的敲入片段，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段，且在该敲入片段中，所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游分别连接有与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，将所述敲入片段连接至载体上，得到所述重组载体。在其中一个实施例中，所述将所述敲入片段连接至载体上还包括如下步骤：以序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的DNA片段为上、下游引物，以小型猪的基因组DNA为模板扩增得到小型猪的两条同源臂以及位于该两条同源臂中间的猪亨廷顿基因第一外显子片段，将该扩增产物经EcoRI和KpnI酶切后连接至经同样内切酶切割制得的pBluescriptKS(-)载体上，形成pBS-HD质粒，然后将所述人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段，得到pBS-HD-KI重组载体。在其中一个实施例中，所述将所述人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段包括如下步骤：以人突变的亨廷顿基因片段为模版，并在其两端设计NcoI和ApaI酶切位点，PCR扩增出连接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段；将pBS-HD质粒与接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段分别进行NcoI和ApaI双酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人亨廷顿基因敲入用的重组载体，其特征在于，所述重组载体中插入有敲入片段，所述敲入片段包括人突变的亨廷顿基因片段以及分别位于所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游的与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段。

【技术特征摘要】
1.一种人亨廷顿基因敲入用的重组载体，其特征在于，所述重组载体中插入有敲入片段，所述敲入片段包括人突变的亨廷顿基因片段以及分别位于所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游的与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段。2.如权利要求1所述的人亨廷顿基因敲入用的重组载体的构建方法，其特征在于，所述人突变的亨廷顿基因片段中的CAG重复序列的数量超过36个，优选为150个，更优选人突变的亨廷顿基因片段的序列如SEQIDNo.13所示。3.一种如权利要求1或2所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：构建含有人突变的亨廷顿基因片段的敲入片段，所述人突变的亨廷顿基因片段为含人亨廷顿基因第一外显子中CAG重复序列突变的序列片段，且在该敲入片段中，所述人突变的亨廷顿基因片段的上游和下游分别连接有与小型猪的亨廷顿基因同源的同源臂，将所述敲入片段连接至载体上，得到所述重组载体。4.如权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述将所述敲入片段连接至载体上还包括如下步骤：以序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的DNA片段为上、下游引物，以小型猪的基因组DNA为模板扩增得到小型猪的两条同源臂以及位于该两条同源臂中间的猪亨廷顿基因第一外显子片段，将该扩增产物经EcoRI和KpnI酶切后连接至经同样内切酶切割制得的pBluescriptKS(-)载体上，形成pBS-HD质粒，然后将所述人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段，得到pBS-HD-KI重组载体。5.如权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述将所述人突变的亨廷顿基因片段插入该两条同源臂的中间替换猪亨廷顿基因第一外显子片段包括如下步骤：以人突变的亨廷顿基因片段为模版，并在其两端设计NcoI和ApaI酶切位点，PCR扩增出连接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段；将pBS-HD质粒与接有酶切位点的人突变的亨廷顿基因片段分别进行NcoI和ApaI双酶切；利用T4DNA连接酶将人突变的亨廷顿基因片段连接至pBS-HD质粒中，得到所述pBS-HD-KI重组载体。6.一种人亨廷顿基因敲入模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：针对小型猪的亨廷顿基因的第一外显子后的内含子序列满足G(N)16NGG序列模式的正链序列部分分别设计两个序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的sgRNA的识别序列，分别记为第一sgRNA识别序列和第二sgRNA识别序列，所述第一sgRNA识别序列和所述第二sgRNA识别序列均与相应内含子正链序列G(N)16一致，N为A、T、C或G，下标16表示N的个数；...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫森，李晓江，赖良学，李世华，
申请(专利权)人：暨南大学，中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44