一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用技术

本发明专利技术提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，属于干细胞技术领域，当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，将培养物进行第一离心分离，将得到的第一上清液进行第二离心分离，将得到的第二上清液进行第三离心分离，将得到的第三上清液过滤，将得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，将得到的第四沉淀经生理盐水洗涤，第五离心分离后，得到的沉淀物为外泌体。采用本发明专利技术的方法，不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量，而且得到的外泌体能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率。

Preparation of exocrine derived from human olfactory mucosa mesenchymal stem cells and application of exocrine body

The present invention provides a preparation method derived from human olfactory mesenchymal stem cells, which belongs to the field of stem cell technology. When the fusion rate of P4 and / or P5 olfactory mesenchymal stem cells is 85 ~ 90%, the first centrifuge separation is carried out, and the obtained first clear liquid is centrifuged by second centrifugation, and the result will be obtained. The second supernatant was separated by third centrifuge, and the obtained third supernatant was filtered, and the filtrate was mixed with the polyethylene glycol solution. After incubating for 8 ~ 10h, fourth centrifugation was carried out. The obtained fourth precipitates were washed by physiological saline, and the precipitates obtained by fifth centrifugation were exocrine. The method of this invention will not damage the vesicles of the exocrine, ensure the amount of exocrine, and the exocrine can promote the proliferation of the human brain microvascular epithelial cells and improve the cell mobility.

【技术实现步骤摘要】
一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用
本专利技术涉及干细胞
，尤其涉及一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法及外泌体的应用。
技术介绍
嗅黏膜间充质干细胞(olfactorymucosamesenchymalstemcells，OM-MSCs)也称为外胚间充质干细胞(ectomesenchymalstemcells,OE-MSC)，又因为定位于嗅黏膜固有层中，也称嗅黏膜固有层间充质干细胞(laminapropriamesenchymalstemcell,LP-MSCs)。OM-MSCs广泛存在于鼻中隔或侧壁的上、中、下鼻甲的鼻黏膜内。作为新发现的一类间充质干细胞，OM-MSCs不仅具有间充质干细胞的一般特性，还具有：①来源稳定，嗅黏膜终生可更新；②细胞提取步骤简单有效；③安全性高，染色体核组分析和肿瘤基因分析显示体外无限传代后没有基因变异；④避免了伦理和法律问题；⑤自体移植，无免疫排斥反应。最为重要的是其发生起源为外胚层，与神经发源具有同源性，也为细胞分化提供更为有效的自然途径。外泌体是细胞内的多囊泡体与细胞质膜融合后主动分泌到细胞外的一种大小在30～140nm的小囊泡。外泌体内含有脂质、蛋白质、miRNA等活性物质，可通过与靶细胞受体结合或水平转移内含物发挥生物学功能。外泌体作为一种新型的细胞间交流方式在细胞间交流中起重要作用。最近的研究发现，干细胞分泌的外泌体可以有效转运mRNA、microRNA和蛋白质，在调控组织再生方面发挥重要作用。至今为止，OM-MSCs被认为是增殖能力最强的MSCs，而MSCs则被认为是产生外泌体能力最强的细胞。目前常用的提取外泌体的方法有单纯超速离心法，但是采用该方法所获取的外泌体分离效果稳定性差，可损伤囊泡，不能保证外泌体所获取量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，不损伤囊泡，能够保证外泌体的获取量。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，使外泌体沉降在第四沉淀中，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。优选的，所述步骤2)第一离心分离的温度为1～6℃，所述第一离心分离的时间为3～8min。优选的，所述步骤3)第二离心分离的温度为1～6℃，所述第二离心分离的时间为20～40min。优选的，所述步骤4)第三离心分离的温度为1～6℃，所述第三离心分离的时间为50～70min。优选的，所述步骤5)过滤使用的滤膜的孔径为0.2～0.25μm。优选的，所述步骤6)滤液与聚乙二醇溶液的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；所述聚乙二醇溶液中聚乙二醇的质量百分含量为15～25％。优选的，所述步骤6)第四离心分离的温度为1～6℃，所述第四离心分离的时间为50～70min。优选的，所述第五离心分离的条件包括：所述步骤7)第五离心分离的温度为1～6℃，所述第五离心分离的时间为60～80min。本专利技术还提供了上述技术方案制备得到的外泌体在制备促进细胞增殖和/或提高细胞迁移药物中的应用。本专利技术提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，使外泌体沉降在第四沉淀中，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。在本专利技术中，细胞培养物经第一离心分离后除去死细胞，经过第二次离心分离后除去细胞碎片，经过第三次离心分离后除去凋亡小体等大囊泡，经过滤后进一步除去大囊泡，得到的滤液与聚乙二醇溶液混合后，聚乙二醇与滤液静置孵育时能形成网状结构，能够聚集捕获滤液中的外泌体，通过第四离心分离，使得外泌体沉降，经过生理盐水洗涤和第五离心分离后，能够除去蛋白和聚乙二醇，得到外泌体，并且不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量。本专利技术实施例的结果显示：采用本专利技术的方法，不会损伤外泌体的囊泡，保证外泌体获取的量，而且得到的外泌体能够促进人脑微血管上皮细胞的增殖和提高细胞的迁移率。附图说明图1为培养第7天，嗅黏膜间充质干细胞光镜结果(200×)；图2为P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞光镜结果(40×)；图3为嗅黏膜间充质干细胞的流式细胞结果；图4为嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体透射电镜结果；图5为嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体NTA粒径结果；图6为嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体westernblot结果；图7为P4和/或P5嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体对人脑微血管内皮细胞增殖作用结果；图8为P4和/或P5嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体对人脑微血管内皮细胞迁移作用对比结果。具体实施方式本专利技术提供了一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。

【技术特征摘要】
1.一种来源于人嗅黏膜间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：1)当P4和/或P5代嗅黏膜间充质干细胞的融合率为85～90％时，得到细胞培养物；2)将所述步骤1)得到的细胞培养物进行第一离心分离，得到第一上清液和第一沉淀，所述第一离心分离的速度为200～400rpm；3)将所述步骤2)得到的第一上清液进行第二离心分离，得到第二上清液和第二沉淀，所述第二离心分离的速度为2,000～3,000rpm；4)将所述步骤3)得到的第二上清液进行第三离心分离，得到第三上清液和第三沉淀，所述第三离心分离的重力加速度为9,000～11,000g；5)将所述步骤4)得到的第三上清液过滤除去大囊泡，得到滤液；6)将所述步骤5)得到的滤液与聚乙二醇溶液混合，静置孵育8～10h后进行第四离心分离，得到第四上清液和第四沉淀，所述第四离心分离的重力加速度为90,000～110,000g；所述聚乙二醇的数均分子量为5000～7000；7)将所述步骤6)得到的第四沉淀依次经生理盐水洗涤、第五离心分离，得到的沉淀物为外泌体；所述第五离心分离的重力加速度为90,000～110,000g。2.根据权利要求1所述的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢明，葛丽特，陈平，寻成峰，段答，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43