本发明专利技术公开了一种检测ｋＲａｓ基因突变的核酸探针、液相芯片及检测方法。所述ｋＲａｓ基因突变检测液相芯片，包括有：包被有氨基修饰的针对ｋＲａｓ基因密码子Ｃｏｄｏｎ １２、１３和／或６１的野生型和突变型探针的微球，以及用于扩增出富集有ｋＲａｓ基因密码子Ｃｏｄｏｎ １２、１３和／或６１的需检测的相应突变位点的、末端具有生物素标记目标序列的引物，本发明专利技术所提供的方法快速，准确，操作简便，且可在一个孔中同步检测多个突变位点，大大提高检测效率。本发明专利技术所述液相芯片可用于ｋＲａｓ基因突变检测，可作为胰腺癌早期诊断的辅助，并且可准确预测分子靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，避免不必要治疗的时效损失和经济损失。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体的是涉及kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测 方法。 背录技术一、 kRas基因突变与胰腺癌的早期诊断Ras基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。Ras基因家族由kRas、 hRas和nRas组成，基因 家族的各成员相互间同源性可达859t。 Ras基因编码的蛋白质是P21蛋白。P21蛋白位于细胞 膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增生信号的调控系统。其激活状态为GTP结合 状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第12、 13和61密 码子的突变。kRas基因激活在胰腺癌的发生中已有肯定的研究，其中以kRas 12密码子点突 变最常见。突变的kRas蛋白p21仅有微弱的GTP酶活性，不能迅速分解GTP,因此ras信号 传导蛋白"锁定"在GTP结合的激活状态，活化状态的ras信号蛋白通过细胞信号传导途径 造成细胞不可控制地增殖、恶变。kRas基因的突变率在不同的肿瘤组织中并不相同。在结肠癌中，其突变频率为43%,肺 癌中为30 %，甲状腺癌中为29 %,膀胱、肝、肾和子宫癌中，则该突变发生频率为10%或低 于10%。在胰腺癌中，kRas基因的突变率髙达75M-95X，突变几乎总是发生在第12位密码子上， 突变方式也几乎皆为CGT、 GTT及GAT，而正常胰腺组织、急慢性胰腺炎、胰岛素瘤、胰腺良 性囊肿及胰腺其他疾病均无K-ras基因突变。同时，kRas基因突变是胰腺癌发生过程中早期 即有的一种表现，且在肿瘤发生过程中突变率不同增生期26%，乳头增生期46%，原位癌 期76%,腺癌期80%，淋巴转移期43%。因此，检测kRas基因第12位密码子有无突变，有 助于临床判断胰腺肿块的良恶性及胰腺癌的诊断。从胰液、胆汁、十二指肠液、粪便、外周 血中检测K-ras基因12密码子点突变是胰腺癌诊断的一个重要辅助工具。二、 kRas基因突变与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药kRas基因是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路中的一个关键的下游调节分子。EGFR 是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为ErbB家族 的四个成员之一，因此又名HERl或ErbBl。 EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞 质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的髙表达或异常表达，为以EGFR为耙 向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。因 此，以表皮生长因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。 其中，EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼(Genfitinib, Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib, 特罗凯，Tarceva)已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。 我国在2005年2月也批准了吉非替尼进入临床。这些药物用于其他肿瘤(如乳腺癌、结肠癌 和胃癌等)的治疗，目前也已经进入临床试验阶段。吉非替尼，厄洛替尼是一种口服的小分子EGFR拮抗剂，可与ATP竞争结合EGFR酪氨酸激 酶区的ATP结合袋从而抑制EGFR的活性，已应用于晚期和不适宜传统化疗方案的非小细胞肺 癌患者的临床治疗，是目前对于部分NSCLC患者治疗最有效的药物。然而，患者对这种分子 靶向药物的反应性与个体的遗传背景相关。2004年6月，美国哈佛医学院的研究人员Lynch 等和Paez等率先报道，肺癌细胞中EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变是靶向治疗药物奏效的 —个必要前提条件。研究结果显示，对EGFR酪氨酸激酶基因编码区突变型肿瘤，吉非替尼的 有效率髙达80%以上，而对无突变的野生型肿瘤上述药物基本无效。这一最新研究结果发表 后受到了各国学者的高度重视，并在不足一年的时间内相继被美国、H本、韩国和我国(包 括台湾)学者的研究所证实(PaoW等,2004; HanSW等，2005: Mitsudomi T等，2005; Huang SF等，2004; Mu XL等，2005)。EGFR外显子19的缺失突变和外显子21的点突变使患者对吉非替尼，厄罗替尼等靶向治 疗药物敏感，而另外有些突变则使患者对这些药物耐受，或者称耐药性。耐药性分原发性耐 药和继发性耐药(获得性耐药)。EGFR外显子20的T790点突变与靶向治疗药物的继发性耐药 相关。而位于EGFR信号传导通路下游的编码GTP酶的kRas基因突变则是吉非替尼 (Gefitinib)、厄罗替尼(Erlotinib)原发耐药的原因。大约159i-30%的非小细胞肺癌患者 (NSCLC)中存在kRas基因点突变，并与患者耙向治疗的预后差相关。这些突变多位于第二 外显子的12和13密码子。研究表明，有kRas基因突变的非小细胞肺癌对激酶抑制剂吉非替 尼和厄罗替尼的敏感性差。这一发现最早由William Pao等人报道。研究者选择了60位对吉 非替尼或厄罗替尼治疗敏感与不敏感的腺癌病人，检测其EGFR突变与kRas突变情况。在所 有对吉非替尼或厄罗替尼治疗不敏感的病人中，有24% (9/38)的病人存在kRas基因的突变； 而所有对这两个耙向治疗药物敏感的病人中，没有一个存在kKas基因突变(0/21)。2006年，Baoli Qin等人则在细胞水平上研究了 EGFR信号传导通路的关键分子与吉非 替尼靶向治疗耐药性之间的关系。作者发现Src和Ras基因的激活可使肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性增强30倍至200倍。此外，韩国的Sae-Won Han等人(Clinical Cancer Res 2006: 12 (8))选择69位接受吉非替尼治疗的非小细胞肺癌病人，检测EGFR基因拷贝数，K-ras基 因突变，HER2， EGFR外显子18-21的突变，以及Akt的磷酸化状况来研究与吉非替尼药物敏 感性相关的因素。分析结果显示，kRas突变的患者均对吉非替尼治疗不敏感。在EGFR野生型 患者中，携带kRas突变或者p-Akt过表达的患者均存在较差的治疗效果，且容易复发(P= 0.017)。 一般来讲，kRas突变和EGFR突变是相互排斥的，EGFR突变主要见于不吸烟者，而 kRas突变更常见于吸烟相关的癌症。 三、kRas基因突变与结直肠癌对西妥昔单抗的耐药kRas基因的突变不仅与非小细胞肺癌对吉非替尼，厄罗替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂 的原发耐药相关，最近的研究还发现这一基因突变还与结直肠癌对西妥西单抗的耐药性密切 相关。表皮生长因子受体(EGFR)靶向药物西妥昔单抗对难治性结直肠癌有效，与伊立替康为主 的化疗方案联合应用时，有助于克服伊立替康耐药。但是，仅部分患者能从西妥昔单抗治疗中 获益，因此明确疗效预测因素非常重要。法国巴黎笛卡尔大学Lievre等报告，采用西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌患者，肿瘤 kRas突变可预测治疗有效性和患者生存率(Cancer Res 2006; 66: (8))。研究者发现，肿瘤细胞kRas突变与西妥昔单抗耐药和总生存期(OS)较短相关。在30例本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于ｋＲａｓ基因突变检测的探针，其特征是：包括有： 针对ｋＲａｓ基因密码子Ｃｏｄｏｎ１２的：５’ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’、和引入酶切位点ＢｓｔＯＩ的５’ＧＡＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’的野生型探针，以及选自碱基序列为５’ＧＡＣＣＴＣＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’、５’ＧＡＣＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’、５’ＧＡＣＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’、５’ＧＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’、５’ＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’、和５’ＧＡＣＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧ３’中的一种或多种的引入酶切位点ＢｓｔＯＩ的突变型探针；和／或 针对ｋＲａｓ基因密码子Ｃｏｄｏｎ１３的：５’ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡ３’、和引入酶切位点ＮａｒＩ的５’ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡ３’野生型探针，以及选自碱基序列为５’ＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡ３’和５’ＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＡ３’中的一种或二种引入酶切位点ＮａｒＩ的突变型探针；和／或 针对ｋＲａｓ基因密码子Ｃｏｄｏｎ６１的：５’ＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴ３’野生型探针、引入酶切位点ＢｃｌⅠ的５’ＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴ３’、和引入酶切位点ＢｇｌⅡ的５’ＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＧＴ３’的野生型探针，以及选自引入酶切位点ＢｃｌⅠ的碱基序列为５’ＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴ３’、５’ＡＧＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴ３’、引入酶切位点ＢｇｌⅡ的碱基序列为５’ＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＧＴ３’中的一种或多种的突变型探针。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴诗扬，任立芬，许嘉森，何嘉英，杨惠夷，林一群，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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