本发明专利技术公开了ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９基因突变检测液相芯片及其检测方法，该液相芯片包括有：分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的微球，所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列选自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６中的序列；野生型和突变型ＡＳＰＥ引物，所述野生型及突变型特异性序列分别选自：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及ＳＥＱ ＩＤＮＯ．６、和／或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８；引物。所述液相芯片检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及苯妥英钠代谢相关基 因CYP2C9、 CYP2C19突变检测液相芯片及其检测方法。
技术介绍
苯妥英钠为抗癲痫药、抗心律失常药，常用于颅脑手术后癫痫的预防，以及癫痫尤其是 癫痫大发作的治疗。这种药物始用于20世纪初，长期作为治疗癫痫的一线药物，其疗效虽好 但有较多与剂量相关的不良反应，且个体差异很大。患者若使用剂量不足，药物不能达到预 期疗效；而稍有过量，又会对患者的神经系统造成严重的毒副作用。苯妥英钠的毒副作用常 见为齿龈增生，儿童发生率高；对神经系统的不良反应常见为眩晕、头痛，严重时可引起眼 球震颤、共济失调、语言不清和意识模糊；此外，血液系统、骨骼系统以及消化系统亦会受 到用药剂量不当的影响。大量的临床研究已经证实，苯妥英钠的疗效与患者体内两个基因的突变关系密切，即 CYP2C9和CYP2C19。苯妥英钠70。/。 90y。由CYP2C9代谢；而CYP2C19是其代谢过程中最重要的次 级代谢酶，CYP2C19的作用随药物浓度的升高而增强。CYP2C9和CYP2C19对降低苯妥英钠毒性和促使 其排泄出体外具有关键作用。在中国人群中，CYP2C9常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2C^2和CYP2C9+3,其中 CYP203基因分布频率约2. 5%; CTP2C19常见的功能减弱等位基因突变型为CTP2C19+2和子3; CYP2C9求3为A1075C突变，发生在外显子7; CYP2C1W2为G681A突变，发生在外显子5; CYP2C19+3为G636A突变，发生在外显子4。这些等位基因的突变使酶活性降低，对药物代谢的 能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定的规律性，表现出正常基因纯合子〉正常基因与 突变基因杂合子 > 突变基因纯合子或杂合子的变化趋势，即我们通常所说的基因剂量效应。 大量研究表明，携有一个或以上功能减弱等位基因突变的患者，在接受苯妥英钠治疗时，如 果不适当减少剂量，将面临较大的毒副作用风险。目前已建立了若干以PCR为基础的检测CYP2C9和CYP2C19基因SNPs的技术，如直接测序法， 半定量PCR技术，PCR—单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污 染、假阳性率高等缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的 需要。而聚合酶链式反应一限制性片段长度多态(PCR—RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的 等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵， 而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微 球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪 作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造 过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不 同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物 素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完 整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光 用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同 色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通6过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测 试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确， 灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多种 突变，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供与苯妥英钠疗效密切相关的CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液 相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2C9基因的两种常见突变等位基因CYP2CW2和CTP2C9"， 以及CYP2C19基因的两种常见突变等位基因CYP2C1W2和CYP2C19沐3。一种CYP2C9和/或CYP2C19基因突变检测液相芯片，包括有(1) .分别包被有特异的anti-tag序列的微球，每种微球具有不同颜色编码，anti-tag序 列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 16 中的序列；(2) .针对每种型别的突变分别设计的野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由3'端的 针对目的基因突变位点的特异性序列和5'端的tag序列组成，所述tag序列能相应地与(1) 中所选的微球上anti-tag序列互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别选自SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6、 和 /或SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8;(3) .用于扩增出需要检测的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的目标序列的引物。 优选地， 一种CYP2C9和/或CYP2C19基因突变检测液相芯片，包括有7(1) . 包被有特异的anti-tag序列的8种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列分别为SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 16中的序列;(2) .针对每种型别突变设计的4对野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5'端的tag序列和3'端的针对目的基因突变位点的特异性序列组成，所述tag序列能分别相应地与(1)中所述微球上anti-tag序列互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别为SEQID NO. 1及SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6、 和SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8;(3).用于扩增出需要检测的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的目标序列的引物。更优选地，所述4对由tag序列和特异性序列组成的特异ASPE引物的为SEQ ID NO. 9的互补序列和SEQ ID NO. l组成的引物、及SEQ ID NO. IO的互补序列和SEQ ID NO. 2组成的引物；SEQ ID NO. ll的互补序列和SEQ ID NO. 3组成的引物、及SEQ ID NO. 12的互补序列和SEQID N0.4组成的引物;SEQ ID NO. 13的互补序列和SEQ ID NO. 5组成的引物、及SEQ ID NO. 14的互补序列和SEQ ID NO. 6组成的引物;和SEQ ID NO. 15的互补序列和SEQ ID NO. 7组成的引物、及SEQ ID NO. 16的互补序列和SEQ ID N0.8组成的引物。优选地，(3)中所述引物为针对CYP2C9 Exon3突变的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有： （１）．分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的微球，每种微球具有不同颜色编码，ａｎｔｉ－ｔａｇ序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列选 自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６中的序列； （２）．针对每种型别的突变分别设计的野生型和突变型ＡＳＰＥ引物，每种ＡＳＰＥ引物由３’端的针对目的基因突变位点的特异性序列和５’端的ｔａｇ序列组成，所述ｔａｇ序列能相应地与 （１）中所选的微球上ａｎｔｉ－ｔａｇ序列互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别选自：ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、和／或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８； （３）．用于扩增出需要检测的、具有ＣＹＰ２Ｃ９和／或ＣＹＰ２Ｃ１９基因突变位点的目标序列的引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，何嘉英，郭元杰，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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