一种乙型肝炎病毒基因分型的方法技术

本发明专利技术公开了一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，涉及病毒分类。该方法基于ＭＡＳＡ液相芯片技术对乙肝病毒基因进行分型，主要根据乙肝病毒八种基因型的特点设计基因型特异的引物及探针，通过两轮ＰＣＲ，分子杂交，再用Ｌｕｍｉｎｅｘ仪器进行检测，根据检测值的大小来确定乙肝病毒属于八种基因型的哪一种。对病人体内的乙肝病毒进行基因分型，将有利于对疾病的进程进行预测，也可用于研究乙肝病毒的进化与发展。与现有技术相比，本发明专利技术具有：操作简单，特异性高，假阳性少，灵敏度高，结果明确，对目前已知的所有８种基因型乙肝病毒都可进行明确的区分，且费用较低，适合大范围的推广应用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒基因分型的方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：　ａ、提取样品中的ＤＮＡ；　ｂ、以步骤ａ中提取的ＤＮＡ为模板进行第一轮ＰＣＲ，在ＰＣＲ管中加入２５ｕＬ下列物质：　１０×ＰＣＲ缓冲液：２．５ｕＬ　 四种脱氧核糖核苷酸：０．５ｕＬ　浓度为２０ｕｍｏｌ／Ｌ所有型引物Ｆ：０．２５ｕＬ　浓度为２０ｕｍｏｌ／Ｌ所有型引物Ｒ：０．２５ｕＬ　ＴａｑＤＮＡ聚合酶：０．５ｕＬ　ＤＮＡ模板：０．５～５ｕＬ　余者为超纯水；　 　其中：所有型引物Ｆ为：ＣＴＧＧＴＣＣＧＴＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧＴＣＣＴＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴ　所有型引物Ｒ为：ＴＡＣＡＧＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧ　Ｃ、将ＰＣＲ管放入ＰＣＲ 仪，条件如下：　ｃ１、９４℃　５分钟　ｃ２、９４℃　３０秒　ｃ３、５７℃　３０秒　ｃ４、７２℃　３０秒　ｃ５、重复２９次步骤ｃ２～ｃ４　ｃ６、７２℃　１５分钟　ｃ７、降到４℃　得到扩 增的目标基因溶液；　ｄ、以扩增的目标基因溶液为模板进行第二轮ＰＣＲ，在ＰＣＲ管中再加入５０ｕＬ下列物质：　１０×ＰＣＲ缓冲液：５ｕＬ　四种脱氧核糖核苷酸：１ｕＬ　浓度为２０ｕｍｏｌ／Ｌ第二轮ＰＣＲ引物Ｆ：０．５ｕＬ　 　浓度为２０ｕｍｏｌ／Ｌ第二轮ＰＣＲ引物Ｒ：０．５ｕＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶：１ｕＬ　扩增的目标基因溶液：０．１～０．５ｕＬ　余者为超纯水；　其中：第二轮ＰＣＲ引物Ｆ为：ＴＡＣＡＧＴＣＧＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＴＣ 　第二轮ＰＣＲ引物Ｒ为：生物素－ＣＴＧＧＴＣＣＧＴＡＣＴＴＣＣＧＡＧＣＧ　ｅ、将ＰＣＲ管放入ＰＣＲ仪，条件如下：　ｅ１、９４℃　５分钟　ｅ２、９４℃　３０秒　ｅ３、６０℃　３０秒　ｅ４、７２℃　３ ０秒　ｅ５、重复２９次步骤ｅ２～ｅ４　ｅ６、７２℃　１５分钟　ｅ７、将温度降到４℃　得到带有生物素标记的目标基因溶液；　ｆ、把所有型探针以共价方式结合到给定颜色的微球上，用杂交缓冲液稀释，使得每微升含有１００ 个微球，　其中：所有型探针的序列为：ＮＨ２－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＧ；　ｇ、在棕色容器中加入：...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王华林，丘志娟，邓菲，袁丽，胡志红，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]