EGFR基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种ＥＧＦＲ基因外显子２０突变的检测探针、液相芯片及其检测方法。所述ＥＧＦＲ基因外显子２０突变的液相芯片，包括有：包被有探针的微球：包被有碱基序列选自于ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６任一种的、针对外显子２０野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２任一种的、针对外显子２０突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微球具有不同颜色编码；以及用于扩增出具有外显子２０突变位点的目标序列的引物。本发明专利技术所提供的方法快速，准确，操作简便，大大提高检测效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体的是涉及EGFR基因外显子20突变的检测探针、液相芯 片及其检测方法。
技术介绍
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种广泛分布于人体各 组织细胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，为ErbB家族的四个成员之一，因此又 名HERl或ErbBl。 EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级 联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表 明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针 对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。因此，以表皮生长 因子受体(EGFR)为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。其中，EGFR 受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼(Genfitinib， Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib，特罗 凯，Tarceva)已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。我国 在2005年2月也批准了吉非替尼进入临床。这些药物用于其他肿瘤(如乳腺癌、结肠癌和胃 癌等)的治疗，目前也已经进入临床试验阶段。吉非替尼，厄洛替尼是一种口服的小分子EGFR 拮抗剂，可与ATP竞争结合EGFR酪氨酸激酶区的ATP结合袋从而抑制EGFR的活性，已应 用于晚期和不适宜传统化疗方案的非小细胞肺癌患者的临床治疗，是目前对于部分NSCLC患 者治疗最有效的药物。尽管在EGFR突变的NSCLC中，吉非替尼、厄洛替尼可以达到较好的效果，但开始治疗 后6~12个月发生的耐药明显限制了患者生存时间的延长。近来研究提示，EGFR外显子20 的插入性突变(D770-N771)可以使受体对EGFR-TKI的敏感性降低100倍，临床上也发现具 有此突变的患者对EGFR-TKI治疗反应不明显。EGFR基因外显子20上的T790M突变大多数 导致获得性耐药，也与原发耐药相关。T790M突变与其他敏感性突变如L585R同时存在时， 癌症细胞对EGFR-TKI也是抵抗的。在未治疗的NSCLC患者中，T790M突变与性别、是否 吸烟或组织学状态无关，但更常见于晚期患者；而且7例对TKI治疗无反应得患者中，3例 与敏感性突变同时存在。在开始对吉非替尼、厄洛替尼有反应但后来复发的患者(具有EGFR 突变)中，存在EGFR外显子20的继发性突变一T790M，耐药的原因是突变导致EGFR结构 发生变化，使TKI与其结合出现位阻效应。 一些研究这认为，药物治疗之前T190M突变细胞 即在患者体内存在，当细胞暴露于TKI后，由于耐药而发挥选择作用，使T790M突变细胞数 目明显增多，由此说明原发耐药和继发耐药的区别可能是T790M突变细胞的多少差异。在TKI治疗后复发的NSCLC中有50%的患者发现有T790M突变，因此，检测EGFR外 显子20基因有无突变，是临床非小细胞肺癌诊断治疗的一个重要辅助工具，可准确预测分子 靶向药物治疗的有效性，便于临床准确用药，显著提高药物疗效，使病人最大限度地受益， 同时可以避免不合理用药所造成的病人医疗费用增加和社会医疗资源浪费，减少不必要治疗 的时效损失以及经济损失。目前，EGFR (酪氨酸激酶区)基因突变的检测标准是组织DNA样本的直接测序。该方 法由Lynch等和Pacz等率先报道，优点是可以确切了解EGFR基因突变的范围和类型，并且 基因突变与吉非替尼临床疗效的关系已得到肯定。然而，基因测序作为临床常规诊断方法也存在不少障碍，有待排除。首先，微量组织标本的检测困难。组织DNA经PCR扩增后进行 基因测序，DNA需要量至少在100 ng以上。目前检测EGFR基因突变的标本主要取自术后 的组织样本，然而70% — 80%的癌症患者在确诊时已难以进行根治性手术切除，无法获得组 织标本进行EGFR基因突变测定。晚期癌症病人唯一能够获得组织的途径是穿刺活检，但肿 瘤穿刺活检组织的样本很少，通常仅含数万个细胞，因而微量组织标本的EGFR基因检测相 当困难。这类标本的EGFR基因检测国内还没有成功的报道。其次，肿瘤穿刺活检手术仅适 用部分病人，标本采集的难度较大。晚期肿瘤多处于破裂出血的高危状态，穿刺活检作为一 种损伤性手术存在一定的医疗风险，并且相当一部分病人由于病灶所处的特殊解剖部位(如脑 转移、病灶邻近心脏及大血管等)而不适宜进行这种手术，导致不能提供肿瘤组织进行基因诊 断。最后，该方法对技术的要求高、结果判读耗时费力。基因测序虽然是最直观、准确的检 测方法，可以明确诊断突变的范围及其类型，但其检测周期长，从收到待检样品到顺利完成 检测发出报告，需要连续的15—21小时。如以正常工作时间进行检测，实际至少需要3个工 作日才能发出检测结果报告，因此，难以满足指导临床用药时效性的要求。因此，建立一种 采样方便、病人痛苦小、特异性好、灵敏度高、准确快速、简便易行且无需组织标本的EGFR 基因突变诊断方法是NSCLC患者应用EGFRTKIs治疗需要解决的重要问题。此外，由于肿瘤的异质性，游离核酸中可能仅有非常小量的突变基因，而含有大量的野 生型基因，混杂大量野生型基因会阻碍突变基因的检出，因此如何排除野生型序列对检测的 干扰是首要解决的关键问题
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供用于EGFR基因外显子20突变检测的探针序列。 实现上述目的的技术方案如下用于EGFR基因外显子20突变检测的探针包括有选自于SEQ ID NO:l SEQ ID NO:6任一种的、针对外显子20引入酶切位点BstUI的野 生型探针，和选自于SEQ ID NO:7 SEQ ID NO: 12任一种的、针对外显子20引入酶切位点 BstUI的突变型探针。本专利技术的另一 目的是提供EGFR基因外显子20突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检 测EGFR基因外显子20上的相关突变，从而可用于预测吉非替尼，厄罗替尼等药物治疗疗效。 实现上述目的的技术方案如下-一种EGFR基因突变检测液相芯片，主要包括有(A)包被有探针的微球包被有碱基 序列选自于SEQ ID NO:l SEQ ID NO:6任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的 微球，和包被有碱基序列选自于SEQIDNO:7 SEQIDNO:12任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球，上述每种探针的碱基序列与氨基之间连接有间隔臂，上述每种微 球具有不同颜色编码；以及(B)用于扩增出具有外显子20突变位点的目标序列的引物，该引物带有酶切位点，且该目标序列的末端具有生物素标记。优选地，(A)包被有探针的微球为包被有碱基序列选自于SEQIDNO:l SEQIDNO:3 任一种的、针对外显子20野生型的氨基修饰探针的微球，和包被有碱基序列选自于SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9任一种的、针对外显子20突变型的氨基修饰探针的微球。以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻， 提高杂交反应的效率以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于ＥＧＦＲ基因外显子２０突变检测的探针，其特征是，包括有：　选自于ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６任一种的、针对外显子２０引入酶切位点ＢｓｔＵＩ的野生型探针，和选自于ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７～ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２任一 种的、针对外显子２０引入酶切位点ＢｓｔＵＩ的突变型探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈玲，郭元杰，吴诗扬，许嘉森，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]