一种位点重组反向克隆基因方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，与基因技术有关。利用生物的位点特异重组克隆，设计反向杂合特异引物，与带重组克隆的载体系统进行体外定向重组与交换，实现目的基因的反向克隆，获得特异的反义基因克隆载体。这样的载体系统用于基因功能鉴定分析和转基因生物的应用。相比现有技术，它不需对基因片段（或ＰＣＲ产物）进行限制性的酶切、分离纯化和连接、插入片段的方向分析等操作，是一种快速、便捷、高效的基因克隆到载体系统的新方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种构建反义基因克隆载体方法，适用于基因沉默研究的基因功能鉴定分析和转基因生物的创造，所指的生物包括植物、微生物和动物，所指的基因为ＤＮＡ和ｃＤＮＡ的片段或全长，所指的位点特指一段可发生重组和交换的ＤＮＡ碱基序列，其特征在于，所述的方法包括：（１）引物设计：将１５－５０ｂｐ的重组位点ａｔｔＢ１的特异序列和目的基因序列的反义链、１５－５０ｂｐ的重组位点ａｔｔＢ２的特异序列和目的基因序列的正义链设计成一组ＰＣＲ引物，然后利用带要λ噬菌体的重组位点（ａｔｔＰ）元件的质粒载体，进 行体外重组克隆；（２）所述的重组克隆元件由ａｔｔＢ、ａｔｔＰ以及它们重组产生的ａｔｔＬ和ａｔｔＲ特异位点成对组成，将成对的重组克隆元件装在农杆菌的Ｔｉ或Ｒｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ序列上，通过Ｂ×Ｐ和Ｌ×Ｒ位点之间的重组与交换，获得反向构建的位 点特异重组转化载体，并用于遗传转化；（２）通过将重组克隆元件连接在ＰＶＸ、ＴＲＶ病毒的核酸载体上，获得反向构建的位点特异重组载体，用于人工接种感染植物；（４）结合ＰＶＸ和Ｔ－ＤＮＡ的重组克隆元件方法，将连接有重组元件的ＰＶＸ或ＴＲＶ 一类的病毒载体再连接到如Ｔｉ或Ｒｉ质粒的转化载体Ｔ－ＤＮＡ上，即可进行稳定的遗传转化和／或可进行感染。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶志彪，李汉霞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]