环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因DD3PCA3试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种定性检测前列腺癌特异基因ＤＤ３↑［ＰＣＡ３］的试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括以下试剂：引物、ＤＮＡ聚合酶、逆转录酶、１０倍ＬＡＭＰ反应缓冲液和显色剂、阳性对照、阴性对照；本发明专利技术采用ＬＡＭＰ法定性检测前列腺癌特异基因ＤＤ３↑［ＰＣＡ３］，因而特异性、敏感性高于普通ＰＣＲ；而且由于不需经３个温度重复，检测时间比ＰＣＲ法短，逆转录反应和等温扩增反应可在同一反应管中同时进行，减少了操作步骤和反应时间；结果判断不需经电泳，特别适合临床单位用于快速定性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种定性检测基因的试剂盒及检测方法，具体涉及一种定性检 测人前列腺癌特异基因DD3peA3的试剂盒及检测方法。
技术介绍
前列腺癌位(Pca)居西方国家男性癌症发病率的第二位，在我国及亚洲国家， 前列腺癌的发病率近年也在明显增髙，有统计说明，我国前列腺癌已居泌尿男 生殖系统肿瘤的前三位，而且发病年龄也日趋年轻化，前列腺癌的早期治疗可 能使患者获得治愈，所以早期诊断和治疗对愈后至关重要。目前临床通过检测前列腺特异性抗原(PSA),达到诊断前列腺癌的目的。但 PSA为前列腺特异性抗原，而非前列腺癌特异性抗原，在前列腺增生症和前列 腺炎等良性前列腺病变中亦可升髙，且近来有研究发现PSA在前列腺以外的器 官亦可能髙表达，暴露出PSA在Pca诊断中的局限性。因此，寻找更为敏感、特异的肿瘤标记物用于Pca的早期诊断和预后检测 具十分重要的意义。DD3P"s是前列腺癌的特异性基因，在前列腺癌组织中高度表达，正常前列 腺组织或者前列腺增生中无表达或低表达，其他肿瘤组织及器官中均无表达。 核酸扩增(PCR)为基础的分子生物学技术的迅速发展，为DD3peA3的检测提 供了一种快速、灵敏的方法，但普通PCR假阳性太髙，不适合临床使用。荧光 定量PCR具有灵敏、准确的优点，但采用TaqMan探针法操作烦琐、费用较髙。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)不需 PCR经过的变性、复性、延伸三个阶段，可在等温条件下1小时内将目的序列 扩增109倍以上，因此不需特殊设备，检测时间更短、敏感性更高；同时4条 的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，特异性更髙，因此在基因检测上明 显优于PCR。但在实际应用中，引物设计及实验条件优化比较烦琐，所以至今国内外尚 未见有关LAMP检测前列腺癌特异基因DD3peA3的文献和专利报道。
技术实现思路
本专利技术目的是解决环介导等温扩增检测前列腺癌特异基因DD3peA3技术领 域的难点，设计合适的引物和优化的测试条件，提供一种定性检测人前列腺癌 特异基因DD3P"s的试剂盒及检测方法，解决了普通PCR假阳性太髙和荧光定 量PCR存在的费用髙的问题。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 一种环介导等温扩增检测人 前列腺癌特异基因DD3P"3的引物，其特征在于由一对外引物和一对内引物 组成，其序列分别如下所示外引物1具有序列表中SEQ ID NO.2所述的碱基序列，具体序列如下所示 AGTGACATGTTTTTGCACATT;外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示 CATCCTTTAAGGAACACATCAA:内引物1具有序列表中SEq ID N0.4所述的碱基序列，具体序列如下所示TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC;内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示 CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG:其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1: 6 8。 设计的引物位于人DD3K"基因外显子3和外显子4a中，具有序列表中 SEQ ID NO.l所述的碱基序列，具体序列为AGGGAAGGACATTAGAAAATGAATTGATGTGTTCCTTAAAGGATG。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 一种人前列腺癌特异基因 DD3PeA3定性检测试剂盒，其特征在于由一套引物、10倍环介导等温扩增反 应缓冲液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、逆转录酶和显色剂组成；所述 的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示 所述引物包括2条外引物和2条内引物，其序列分别如下 外引物i具有序列表中SEQ ID N0.2所述的碱基序列，具体序列如下所示 AGTGACATGTTTTTGCACATT;外引物2具有序列表中SEQ ID NO.3所述的碱基序列，具体序列如下所示 CATCCTTTAAGGAACACATCAA;内引物1具有序列表中SEQ IDNO.4所述的碱基序列，具体序列如下所示 TCCCAGGGATCTCTGTGCTTCAGCCCCTTTAAATATCCAC:内引物2具有序列表中SEQ ID NO.5所述的碱基序列，具体序列如下所示 CGCCATCTTGGGTCATCGATATGTCCTTCCCTCACAAG;其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1: 6 8;所述DNA 聚合酶为具有链置换作用的BstDNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述 阳性对照为含人前列腺癌特异基因DD3peA3cDNA的样品阴性对照为双蒸水； 所述逆转录酶采用鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，活力为10个活性单位/ 微升；所述显色剂为20XSYBR Green I。1. 上述技术方案中，所述10倍环介导等温扩增反应缓冲液(通常用"10 XLAMP反应液"表示，数字IO表示使用时稀释的倍数)由200mM三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)、 lOOmM氯化钾(KC1 ) 、 lOOmM硫酸铵((NH4)2S04)、 40 100mM硫酸镁(MgS04)、 4 10M甜菜碱(Betaine)、 5 lOmM的dNTPs和1%的质量百分浓度的曲拉通X-100 (Triton X-100)组成。2. 上述技术方案中，所述阳性对照的制备方法为按常规的Trizol法由前 列腺癌组织中提取RNA，逆转录成cDNA后，PCR法扩增包含等温扩增区的一 段序列，具体序列如序列表中SEQ ID NO.l所述；扩增片段经测序鉴定后，装 入T载体克隆后，抽提质粒DNA，测定DNA浓度，然后调整浓度为每微升106 拷贝作为阳性对照。3. 上述技术方案中，所述的mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所 含有溶质的摩尔数。4. 上述技术方案中，所述的SYBRGreenI为高灵敏度的DNA荧光染料， SYBRGreenl与双链DNA的亲和力非常髙。对分子生物学中常用的酶没有抑 制作用。一种检测人前列腺癌特异基因DD3peA3的检测方法，具体包括以下步骤(1) 常规方法提取组织、血液或尿液中的RNA;(2) 配置扩增体系，在每25U1扩增体系中，含外引物5pmol，内引物30 40pmol， 10倍环介导等温扩增反应缓冲液2.51U,步骤(l)中RNA提取液2 5li 1， llU的Bst酶，O.lU 1鸟类成髓细胞白血病病毒逆转录酶，其余为水；60 65匸恒温反应1小时；(3)反应结束后加llil显色剂，于紫外灯下观察，颜色变为绿色说明检测结 果阳性。上述技术方案中，步骤(2)中RNA提取液的用量根据提取物来源不同而调整， 具体调整方法为组织来源的RNA提取物用1 21M，血液、尿液等体液用4 5U 1。本专利技术工作原理是环介导等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物 扩增所需要的模板，即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基 因DNA片段，由于内引物扩增的DNA片段含有该引物5'端DNA片段的反向 互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构另外一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环介导等温扩增检测人前列腺癌特异基因ＤＤ３↑［ＰＣＡ３］的引物，其特征在于：由一对外引物和一对内引物组成，其序列分别如下所示：　外引物１具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所述的碱基序列，具体序列如下所示：ＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＴ ＴＴＴＧＣＡＣＡＴＴ；　外引物２具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３所述的碱基序列，具体序列如下所示：ＣＡＴＣＣＴＴＴＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＴＣＡＡ；　内引物１具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４所述的碱基序列，具体序列如下所 示：ＴＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＣ；　内引物２具有序列表中ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５所述的碱基序列，具体序列如下所示：ＣＧＣＣＡＴＣＴＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧＡＴＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＴＣ ＡＣＡＡＧ；　其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为１∶６～８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱斌，贾瑞鹏，葛海燕，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]