CRISPR杂合DNA/RNA多核苷酸及使用方法技术

本公开提供DNA引导的CRISPR系统；用于与CRISPR系统一起使用的包含DNA、RNA及其混合物的多核苷酸；以及涉及此类多核苷酸和DNA引导的CRISPR系统的使用方法。

CRISPR heterozygous DNA/RNA polynucleotide and its use method

The present disclosure provides DNA guided CRISPR system, polynucleotide containing DNA, RNA and its mixture for use with CRISPR system, as well as the use of such polynucleotide and DNA guided CRISPR system.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRISPR杂合DNA/RNA多核苷酸及使用方法相关申请的交叉引用本申请主张2015年1月28日提交的美国临时专利申请序列号62/108,931和2015年11月5日提交的美国临时专利申请序列号62/251548(其中所有都通过引用并入本文)的权益。序列表本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2016年1月26日创建，命名为0198470101PTWO_SL.txt，且大小为83,522字节。背景集群固定间隔短回文重复(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPR)和CRISPR相关的(Cas)系统是Ishino在大肠杆菌中首次发现的原核免疫系统。Ishino等人.1987(JournalofBacteriology169(12):5429–5433(1987))。该免疫系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸来提供针对病毒和质粒的免疫。有两个主要阶段参与该免疫系统：第一是获得，第二是干扰。第一阶段涉及切割入侵病毒和质粒的基因组，并将其区段整合至生物体的CRISPR基因座中。整合至基因组中的区段被称为原间隔区，且有助于保护生物体免于相同病毒或质粒的后续攻击。第二阶段涉及攻击入侵病毒或质粒。该阶段依赖于原间隔区被转录成RNA，该RNA在一些加工之后，然后与入侵病毒或质粒的DNA中的互补序列杂交，同时还与有效切割DNA的蛋白或蛋白复合物缔合。有几种不同的CRISPR/Cas系统，并且这些的命名和分类随着系统的进一步表征而变化。在II型系统中，存在两条RNA链，CRISPRRNA(crRNA)和反式活化CRISPRRNA(tracrRNA)，其作为CRISPR/Cas系统的一部分。tracrRNA与前crRNA的互补区域杂交，导致前crRNA成熟为crRNA。由tracrRNA和crRNA形成的双链体被蛋白Cas9识别，并且与蛋白Cas9缔合，所述蛋白Cas9被与靶核酸中的序列互补并与之杂交的crRNA的序列引导至靶核酸。已经表明，基于RNA的免疫系统的这些最小组分可以被重新编程为通过使用单一蛋白和两个RNA引导序列或单一RNA分子以位点特异性方式靶向DNA。CRISPR/Cas系统优于涉及内切核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录活化物样效应子核酸酶(TALEN)(其可能需要每个新靶基因座的重新蛋白工程改造)的其它基因组编辑方法。作为RNA引导的系统，CRISPR/Cas系统可容易出现RNA-DNA杂交结构的问题，诸如RNA链的RNaseA降解和RNA-DNA错配的更高可能性。此外，DNA寡核苷酸的合成比RNA寡核苷酸的合成更经济和稳健。与天然存在的RNA引导的CRISPR系统相比，DNA引导的CRISPR系统还可以将额外机制募集至特定靶标。需要克服与基于RNA的CRISPR/Cas系统相关的问题的改进系统，获得降低的成本和增加的DNA合成的稳健性，并改进CRISPR/Cas系统的特异性。专利技术概述在一些实施方案中，本公开提供用于与2类CRISPR系统一起使用的单一多核苷酸，其包含：包含脱氧核糖核酸(DNA)的靶向区域；和包含核糖核酸(RNA)的活化区域。在一些实施方案中，所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物；且所述活化区域包含DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，本公开提供用于与2类CRISPR系统一起使用的单一多核苷酸，其包含：包含脱氧核糖核酸(DNA)的靶向区域；和包含与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的多核苷酸区域的活化区域。在一些实施方案中，所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物；且所述活化区域包含DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结(nexus)和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与Cas9蛋白相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域与Cpf1蛋白相互作用。在一些实施方案中，本公开提供2类CRISPR系统，其包含：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(DNA)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；和位点定向多肽。在一些实施方案中，所述核酸是DNA，在一些实施方案中，所述核酸是RNA，在一些实施方案中，所述核酸是RNA和DNA的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是Cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，所述2类CRISPR系统还包含供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供2类CRISPR系统，其包含：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(DNA)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列；和位点定向多肽。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是Cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽与所述活化区域相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含RNA、DNA或DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，本公开提供用于与2类CRISPR系统一起使用的两个多核苷酸，其包含：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(DNA)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；和第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物，所述活化区域包含DNA和RNA的混合物，且所述第二多核苷酸包含DNA和RNA的混合物。在一些实施方案中，本公开提供修饰靶核酸分子的方法，所述方法包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(DNA)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；和位点定向多肽，其中所述单一多核苷酸与所述位点定向多肽形本文档来自技高网...

【技术保护点】
单一多核苷酸，其包含：包含脱氧核糖核酸(DNA)的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；其中所述单一多核苷酸用于与2类CRISPR系统一起使用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.28 US 62/108931;2015.11.05 US 62/2515481.单一多核苷酸，其包含：包含脱氧核糖核酸(DNA)的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；其中所述单一多核苷酸用于与2类CRISPR系统一起使用。2.权利要求1的多核苷酸，其中所述活化区域包含DNA。3.权利要求1的多核苷酸，其中所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物。4.权利要求1的多核苷酸，其中所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物，且所述活化区域包含DNA和RNA的混合物。5.权利要求1的多核苷酸，其中所述活化区域在所述靶向区域的下游。6.权利要求5的多核苷酸，其中所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。7.权利要求1的多核苷酸，其中所述活化区域在所述靶向区域的上游。8.权利要求7的多核苷酸，其中所述活化区域包含茎环结构。9.权利要求1的多核苷酸，其中所述活化区域与Cas9蛋白相互作用。10.权利要求1的多核苷酸，其中所述活化区域与Cpf1蛋白相互作用。11.2类CRISPR系统，其包含：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(DNA)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；和位点定向多肽。12.权利要求11的2类CRISPR系统，其中所述活化区域在所述靶向区域的下游，且其中所述位点定向多肽包含Cas9。13.权利要求12的2类CRISPR系统，其中所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。14.权利要求11的2类CRISPR系统，其中所述活化区域在所述靶向区域的上游，且其中所述位点定向多肽包含Cpf1。15.权利要求14的2类CRISPR系统，其中所述活化区域包含茎环结构。16.权利要求11的2类CRISPR系统，其中所述位点定向多肽与所述活化区域相互作用。17.权利要求11的2类CRISPR系统，其中所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物。18.权利要求11的2类CRISPR系统，其中所述活化区域包含DNA和RNA的混合物。19.权利要求11的2类CRISPR系统，其中所述靶向区域包含DNA和RNA的混合物，且所述活化区域包含DNA和RNA的混合物。20.权利要求11的2类CRISPR系统，其还包含供体多核苷酸。21.2类CRISPR系统，其包含：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(DNA)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(RNA)的活化区域；第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列；和位点定向多肽。22.权利要求21的2类CRISPR系统，其中所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。23.权利要求21的2类CRISPR系统，其中所述位点定向多肽选自Cas9和Cpf1。24.权利要求21的2类CRISPR系统，其中所述位点定向多肽与所述活化区域相互作用。25.权利要求21的2类CRISPR系统，其中所述活化区域还包含DNA。26.权利要求21的2类CRISPR系统，其中所述第二多核苷酸包含RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：AP梅，PD多诺霍埃，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US