一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术属于应用环境微生物和农业领域，公开了一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用。一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长1053bp，编码350个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。龙胆酸双加氧酶基因是首个公开能降解麦草畏中间代谢产物3‑氯龙胆酸的基因，它编码的蛋白能将龙胆酸和3‑氯龙胆酸开环降解。本发明专利技术提供的龙胆酸双加氧酶能在30min内降解100mg/l的龙胆酸和3‑氯龙胆酸。因此，龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大，龙胆酸双加氧酶蛋白DsmD在降解麦草畏以及苯环类物质中应用前景很好。

A gentienate dioxygenase and its encoding gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用
本专利技术属于环境微生物和农业领域，涉及一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用,具体涉及参与麦草畏微生物降解过程中的一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因的应用。
技术介绍
化学农药是保障现代农业生产力的重要手段，合理使用农药可以有效的防治作物病害，提高作物产量，但是一旦农药使用不当会造成土壤、水体等环境药害。除草剂的使用能有效减轻农业劳动强度，提高作物产量，但是随着除草剂的大量使用，其残留对土壤造成的危害越来越严重。微生物修复技术是一种原位生物修复技术，效果好，费用低，无二次污染，适合大面积面源污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。抗除草剂转基因是解决除草剂药害的有效途径，而抗除草机的基因一般均来自微生物降解基因。麦草畏(dicamba)属安息香酸系除草剂，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果。麦草畏用于苗后喷雾，药剂能很快被杂草的叶、茎、根吸收，通过韧皮部向上、下传导，多集中在分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物激素的正常活动，从而使其死亡，能防除200多种杂草，广泛应用于玉米、高粱和小麦等农田杂草防治，目前全球使用量达1.5万吨。同时麦草畏因广谱、高效、低毒和杂草抗性产生慢等优点，被认为是理想的抗除草剂转基因靶标除草剂。麦草畏在土壤中稳定，一般能保持40天以上。麦草畏在环境中的降解的主力军是微生物，目前已筛选到多种麦草畏的降解菌株，克隆到多个麦草畏降解基因，关于麦草畏的微生物降解目前基本上第一步都是脱甲基生成无除草活性的3,6-二氯水杨酸3,6-DCSA，克隆到的基因和研究的酶均为麦草畏脱甲基酶。美国孟山都公司利用来自细菌的麦草畏脱甲基酶基因(dmo)(专利US7105724B2)成功构建抗麦草畏和草甘膦复合性状的转基因大豆和抗麦草畏、草甘膦和草铵膦的棉花，已经进入商品化阶段。可以预见，随着抗麦草畏转基因作物的商业化推广，麦草畏的使用量会大幅度提高。但是，到目前为止，微生物降解麦草畏微生物降解的第一步脱甲基产物3,6-DCSA的代谢途径及其分子机制还不清楚，这严重制约了对麦草畏的环境行为和生态安全方面的研究。因此有必要深入研究麦草畏的迁移、转化和降解等环境行为及生态安全性。获得麦草畏脱微生物代谢过程中降解基因和酶在治理农药残留中主要具有以下作用，(一)通过现代微生物发酵技术将酶制剂实现土壤原位修复。(二)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，综上所述，开展麦草畏降解过程中的降解基因、酶的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有麦草畏降解途径的研究的缺乏，提供一个龙胆酸双加氧酶基因，该基因参与麦草畏下游降解路径，同时能降解龙胆酸，龙胆酸是苯环类物质降解的主要开环产物之一，龙胆酸双加氧酶基因的应用具有重要的价值。本专利技术的又一目的是提供该龙胆酸双加氧酶基因编码的蛋白DsmD的应用。一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD编码的双加氧酶蛋白DsmD，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。含有所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的重组表达载体。所述的重组表达载体，优选是将所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD插入pET-24b(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。含有所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的基因工程菌。所述的基因工程菌的表达菌株优选大肠杆菌BL21(DE3)。所述龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建麦草畏下游降解产物3-氯龙胆酸及龙胆酸转基因作物中的应用。所述龙胆酸双加氧酶基因dsmD在降解龙胆酸及3-二氯龙胆酸中的应用。所述龙胆酸双加氧酶DsmD在降解龙胆酸及3-二氯龙胆酸中的应用。所述龙胆酸双加氧酶DsmD在去除土壤、水体中麦草畏中间产物3-氯龙胆酸和龙胆酸中的应用。有益效果：本专利技术提供的龙胆酸双加氧酶能在30min内降解100mg/l的龙胆酸和3-氯龙胆酸。因此，龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大，龙胆酸双加氧酶蛋白DsmD在降解麦草畏以及苯环类物质中应用前景很好。附图说明：表1麦草畏高效降解菌RhizorhabdusdicambivoransNdbn-20的底物谱图1麦草畏脱甲基产物3,6-二氯水杨酸(3,6-DCSA)代谢途径的推测图2龙胆酸双加氧酶DsmDSDS-PAGE图3龙胆酸双加氧酶DsmD降解龙胆酸的紫外扫描图图4：龙胆酸双加氧酶DsmD降解3-氯龙胆酸的紫外扫描图图5：龙胆酸双加氧酶DsmD降解3,6-二氯龙胆酸的紫外扫描图图6：龙胆酸双加氧酶DsmD降解3,6-二氯龙胆酸的HPLC以上实施例中使用的微生物来源如下：大肠杆菌DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌高表达载体pET-24b(+)购自Novegen公司，表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。生物材料保藏信息Ndbn-20，分类命名为RhizorhabdusdicambivoransNdbn-20，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏日期为2014年11月5日，保藏编号为CCTCCNO:M2014550。具体实施方式实施例1.龙胆酸双加氧酶基因dsmD的克隆1.1龙胆酸双加氧酶基因的查找1.1.1麦草畏高效降解菌RhizorhabdusdicambivoransNdbn-20的底物谱实验本实验的研究材料为由本实验室成员分离得到的麦草畏高效降解菌RhizorhabdusdicambivoransNdbn-20，该菌株保存于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO:M2014550，保藏日期为2014年11月5日。Ndbn-20的底物谱实验是在无机盐培养基中，加入适当浓度的3,6-DCSA类似物，定时取样采用紫外扫描的方法检测降解情况，降解情况如表1。经过底物谱实验发现Ndbn-20能够降解龙胆酸，而不能降解邻苯二酚，因此推测3,6-DCSA降解反应的开环底物可能是龙胆酸或者龙胆酸的类似物3,6-二氯龙胆酸。表1麦草畏高效降解菌RhizorhabdusdicambivoransNdbn-20的底物谱1.1.2查阅文献对麦草畏降解下游途径进行推测通过查阅麦草畏及3,6-DCSA降解相关文献，在1998年，JO¨RNWERWATH研究发现在麦草畏降解菌株Sphingomonassp.RW5中克隆到的龙胆酸双加氧酶基因gtdA(1053bp)经过诱导表达得到的龙胆酸双加氧酶，不仅能够降解龙胆酸(Km＝15mM)，而且能少量降解3,6-二氯龙胆酸(Km＝754mM)。而且CorkandKrueger在麦草畏降解菌株StenotrophomonasmaltophiliaDI-6中，采用TLC和HPLC的方法，初步推测3,6-DCSA第一步的代谢产物可能为3,6-二氯龙胆酸，然后在龙胆酸双加氧酶的作用下进行开环降解。因此我们推测3,6-DCSA降解的最有可能的降解途径是经由3,6-二氯龙胆酸进行开环降解,预测的3,6-DCSA降解途径如图1。1.1.3通过比对野生株和突变株的基因组查找龙胆酸双加氧酶基因实施例1.3,6-DCSA羟基化酶基因的克隆1.1突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD编码的角度双加氧酶蛋白DsmD，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.含有权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于是将权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD插入pET-24b(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。5.含有权利要求1所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的基因工程菌。...

【专利技术属性】
技术研发人员：何健，李娜，姚利，丁德荣，陶青，
申请(专利权)人：南京农业大学，北京大北农生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32