检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法技术

本发明专利技术提供了一种检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法，涉及生物技术领域，该检测支原体的引物，能够同时扩增多种支原体16SrDNA保守区。该引物在检测支原体中的应用，能够同时检测出多种支原体，具有广谱性，扩大了适用范围。该检测支原体的方法，检测快速，广谱性强，灵敏度高，可同时检测多个样品，降低了检测成本。缓解了现有技术中存在的缺乏一种具有广谱性的能够同时快速检测多种支原体的产品和方法的问题。

Detection of Mycoplasma and its application and application of the primers and methods

The invention provides a primer, a product and a method for detecting mycoplasma, and relates to the field of biotechnology. The primer for detecting mycoplasma can simultaneously amplify multiple 16SrDNA conserved regions of Mycoplasma. The application of the primers in the detection of mycoplasma can detect a variety of Mycoplasma at the same time, which is broad-spectrum and expands the scope of application. The method of detecting mycoplasma is fast, broad-spectrum and sensitive. It can detect multiple samples at the same time and reduce the cost of detection. It alleviates the lack of a broad spectrum of products and methods that can detect many Mycoplasma at the same time.

【技术实现步骤摘要】
检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种检测支原体的引物和应用及应用其的产品和方法。
技术介绍
支原体(Mycoplasma)又称霉形体，是目前发现的最小最简单的原核生物，支原体中唯一可见的细胞器是核糖体。支原体污染是细胞培养过程中最常见的污染之一，特别是在哺乳动物细胞的培养过程中，主要原因有：支原体体积非常小，直径为0.1μm，一般过滤除菌无法去除，光学显微镜下难以看清它的形态结构；支原体生命力顽强，能在pH7.6～8.0条件下生存，且对青霉素有抗药性；支原体污染初期，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢、形态变圆。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染、培养基的污染、污染支感染的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。目前发现，至少有二十多种支原体能污染细胞，其中最常见的有：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)、唾液支原体(M.salivarium)、肺支原体(M.pulmonis)和梨支原体(M.pirum)等。支原体污染最终会导致细胞死亡，不过更常见的情况是，支原体与细胞共存。在这种过程当中，支原体慢慢增殖，直至对细胞产生明显的影响，如干扰细胞迁移、信号转导、淋巴细胞活化和细胞因子表达。对于相关科研工作者来说，支原体污染最严重的后果是污染在不知不觉中改变许多参数和实验结果，例如细胞因子转录和表达水平的变化，病毒对细胞活力和增殖的影响，外源物质对细胞生理的调控作用等，使研究成果的可信度降低甚至得到错误数据。并且由于污染需要重新购买或者复苏细胞以重新得到能够稳定生长传代的细胞，给科研工作者的时间和科研成本造成巨大的浪费。常用的支原体检测手段包括传统的培养法、ELISA法、PCR法等，目前PCR法是主流的支原体检测方法，然而目前已有的PCR支原体检测手段仍存在诸多问题，例如，灵敏度不够或特异性不够等。并且，目前主流试剂盒只能针对某一种支原体，广谱性差，不适于实际上存在多种支原体能够污染细胞的实际情况，不适于实际实际科研和实验室中的应用。因此，一种具有广谱性的能够同时快速检测多种支原体的产品和方法是目前有待解决的问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种检测支原体的引物，本专利技术的第二目的在于提供一种检测支原体的引物的应用，本专利技术的第三目的在于提供一种检测支原体的方法，缓解了现有技术中存在的缺乏具有广谱性的能够同时快速检测多种支原体的产品和方法的技术问题。一种检测支原体的引物，所述引物用于扩增支原体16SrDNA；所述引物包括PmyF和PmyR，所述PmyF具有如SEQIDNO.1所示序列，所述PmyR具有如SEQIDNO.2所示序列。进一步的，所述引物扩增的支原体包括以下种类：Mycoplasmapirum、Mycoplasmaarginini、Mycoplasmafermentans、Mycoplasmahominis、Mycoplasmahyorhinis、Mycoplasmaorale、Mycoplasmapulmonis、Mycoplasmasalivarium、Mycoplasmatimone、Mycoplasmafaucium、Mycoplasmaspumans、Mycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasmaauris、Mycoplasmaalkalescens、Mycoplasmaarthritidis、Mycoplasmafalconis、Mycoplasmagypis、Mycoplasmasubdolum、Mycoplasmaanseris、Mycoplasmacanadense、Mycoplasmazalophi、Mycoplasmacloacale和Mycoplasmabuccale。一种上述引物在制备检测支原体产品中的应用。一种包含上述引物的试剂盒。进一步的，所述试剂盒包括如下试剂：反应试剂、阴性对照、阳性对照。所述反应试剂包括上述引物、dNTP、DNA聚合酶和Buffer。进一步的，所述阴性对照为DNA-freeddH2O。进一步的，所述阳性对照为猪鼻支原体基因组DNA。进一步的，所述试剂盒还包括荧光染料。一种检测支原体的方法，应用上述的引物和上述的试剂盒。进一步的，所述方法包括如下步骤：以所述引物为扩增引物，以待测样本的DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，得到待测样本的Ct值，根据所述待测样本的Ct值在标准曲线中对应的模板含量得到待测样本的模板含量。本专利技术提供的检测支原体的引物，能够同时扩增多种支原体16SrDNA保守区。本专利技术提供的引物在检测支原体中的应用，能够同时检测出多种支原体，具有广谱性，扩大了适用范围。本专利技术提供的检测支原体的方法，检测快速，广谱性强，可同时检测多个样品，降低了检测成本，该方法灵敏度高，可检测低浓度的支原体污染，为细胞培养中支原体污染的早期排查和提供了一种简便快速高效的方法，节约了科研成本和时间。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1提供的引物PmyF和PmyR扩增支原体16SrDNA的电泳图；图2为本专利技术实施例2提供的检测引物PmyF和PmyR扩增支原体16SrDNA灵敏度的电泳图；图3为本专利技术实施例3提供的Ct至在5-40范围内的标准曲线；图4为本专利技术实施例3提供的Ct至在5-37范围内的标准曲线；图5为本专利技术实施例3提供的标准曲线的扩增曲线；图6为本专利技术实施例3提供的标准曲线的溶解度曲线。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供了一种检测支原体的引物，该引物用于扩增支原体16SrDNA；上述引物包括PmyF和PmyR，上述PmyF具有如SEQIDNO.1所示序列，上述PmyR具有如SEQIDNO.2所示序列。上述引物可扩增出多种支原体16SrDNA基因保守区。16SrRNA基因是原核微生物的标志基因，具有高度保守型，适合作为标志性基因用于原核微生物的鉴别。16SrDNA基因序列可以分为所有原核生物均相同的保守序列、种属特异性的半保守序列和菌种特异性的序列。本专利技术选择在支原体中16SrDNA基因保守序列部分，设计扩增引物，可扩增出多种支原体的16SrDNA基因保守区。在一个可选的实施方式中，上述引物扩增的支原体包括以下种类：Mycoplasmapirum、Mycoplasmaarginini、Mycoplasmaf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测支原体的引物，其特征在于，所述引物用于扩增支原体16SrDNA；所述引物包括PmyF和PmyR，所述PmyF具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述PmyR具有如SEQ ID NO.2所示序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测支原体的引物，其特征在于，所述引物用于扩增支原体16SrDNA；所述引物包括PmyF和PmyR，所述PmyF具有如SEQIDNO.1所示序列，所述PmyR具有如SEQIDNO.2所示序列。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物扩增的支原体包括以下种类：Mycoplasmapirum、Mycoplasmaarginini、Mycoplasmafermentans、Mycoplasmahominis、Mycoplasmahyorhinis、Mycoplasmaorale、Mycoplasmapulmonis、Mycoplasmasalivarium、Mycoplasmatimone、Mycoplasmafaucium、Mycoplasmaspumans、Mycoplasmaphocicerebrale、Mycoplasmaauris、Mycoplasmaalkalescens、Mycoplasmaarthritidis、Mycoplasmafalconis、Mycoplasmagypis、Mycoplasmasubdolum、Mycoplasmaanseris、Mycop...

【专利技术属性】
技术研发人员：李帅，宋秀丽，徐晓勇，杨威威，
申请(专利权)人：杭州华安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33