一种检测普氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术提供了用于检测普氏立克次体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在普氏立克次体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针及基于普氏立克次体特异性保守序列设计的，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术RPA应用于普氏立克次体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸试检测纸条实现可视化判别。本发明专利技术建立的检测方法灵敏度可达10拷贝数/μL，特异性高，对硬件设备的要求很低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测普氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途
本专利技术属于生物
，涉及普氏立克次体的分子生物学，涉及一种检测普氏立克次体的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测普氏立克次体的方法、其专用引物和探针及其用途。
技术介绍
普氏立克次体（Rickettsiaprowazekii）俗称流行性斑疹伤寒，为专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，对外界环境抵抗力强、存活时间长，人类和动物普遍易感，且可通过气溶胶广泛传播，是高致死性、已生物战剂化的病原体之一。流行性斑疹伤寒为虱传播，临床症状较重，主要表现为高热、头痛、皮疹，甚者神经症状显著，可出现听觉障碍、神志昏迷直至死亡。临床表现当人受到感染后，经10-14天的潜伏期，骤然发病，有剧烈头痛、周身痛和高热，4-7天后出现皮疹，严重的为出血性皮疹。有的还伴有神经系统、心血管系统等症状和其他实质器官损害。流行性斑疹伤寒，在人口密集和昆虫繁盛的环境内比较严重。当流行时，病人平均死亡率20%，严重时可达70%。病原体借人虱在人群中传染，所以灭虱是预防流行性斑疹伤寒的重要措施。对立氏立克次体的检测方法主要包括平板分离培养法、血清学技术、荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的立氏立克次体的检测方法有重要意义。近几年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDxInc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析检测试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
技术实现思路
本专利技术一种检测普氏立克次体的RPA方法，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测普氏立克次体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测普氏立克次体的检测方法。因此本专利技术的第一个目的是提供用于检测普氏立克次体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据普氏立克次体的保守基因设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了普氏立克次体基因的保守区，位于普氏立克次体全基因组（GenBank:AJ235270）第16680至17240核苷酸位点，此区域含有561个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性引物。筛选的特异性引物包括正向引物prf20和反向引物prr246，共两条，分别位于普氏立克次体全基因组（GenBank:AJ235270）第16699至16728核苷酸位点和第16896至16925核苷酸位点，具有如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，引物的长度为30bp以上，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。SEQIDNO.1：AAACAGGAAATTAATTCTATTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAGAATCACAACAGTTTAAAAAAACTAAAAGTCTAGAAGATATAGAAGATGGATCTTTATCATCACAATTAAAGCAAACTAAATATAAATCGGTGTTATCACCTTCTTCTTATGTTAACGACATGTTTAGTAATGAGCATCATCAAAACTCTAGCATTGAACTACCAAAGTTGTTGCATAGTTCATTGAGTGATACGAACAGTTCGCTTAATGATTGTATAAATCAACTACGATGTGCAAATACATCAGATGTATATAATTTATCATATACACTTTCAAATAAAACAAAGCAATTAAGTATTGATGAACTCAAAAATACATTAGAACAAATGCAAACTTCTCCTAATATAAATATAGTATTGCCTATGCTAATTAGAGTACAACAAGATTATGTAAATGAGGTTGCTGAAATATACCAGCAGACTATAGAACAAAGAAAGCAAAACCCAAGTGAGCAGGCAAAAAATCAAGAAGAGGTAGTAGCAGCTTACTTTACTCAAGAATACGATAAACTASEQIDNO.2：5’TTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAG3’SEQIDNO.3：5’GTTCGTATCACTCAATGAACTATGCAACAA3’本专利技术的第二个目的是提供用于检测普氏立克次体的探针。所述探针是根据普氏立克次体的特异性保守序列设计的，同时经过软件对基因同源序列进行对比分析，进一步确定了普氏立克次体基因的保守区，此区域含有561个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。从SEQIDNO.1序列内筛选设计特异性探针，设计探针具有SEQIDNO.4所示的寡核苷酸序列，该序列位于普氏立克次体全基因组（GenBank:AJ235270）第16850至16895核苷酸位点之间，且5’端标记荧光素FAM，3’端添加延伸阻断基团（如磷酸基团），在第30-31位碱基之间插入一个四氢呋喃（THF）。SEQIDNO.4：5’GTTTAGTAATGAGCATCATCAAAACTCTAGATTGAACTACCAAAG3’所述探针的长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp．所述探针由荧光素（羧基荧光素FAM）、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团（磷酸基团）几部分组成。所述探针与扩增后的标记有生物素的DNA退火，RPA系统中的nfo酶将在THF部位切断探针，使探针能在聚合酶作用下在3’端继续延伸，最终获得FAM和Biotin双标记的扩增产物。本专利技术的第三个目的是提供了用于普氏立克次体快速检测的RPA检测方法，所述方法采用上述的RPA引物和探针进行扩增，并结合侧向层析核酸检测试纸条(Hybridetect2T，MileniaBiotecGmbH,Germany)进行可视化判断。本专利技术一种检测普氏立克次体的RPA方法，包括以下步骤：（1）以待测样品基因组DNA为模板，在所述引物组和探针的标记下进行RPA反应；（2）结果判断：用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测，检测线和质控线均显出，判断结果为阳性结果；检测线未显出，质控线显出，判断结果为阴性结果；质控线未显出，不管检测线是否显出，均判定结果无效。优选地，本专利技术一种检测普氏立克次体的RPA方法，具体步骤如下：（1）扩增试剂准备和加样：将10μmol/L正向引物2.1μL、5μmol/L反向引物2.1μL、10μmol/L探针0.6μL、1μL样品、12.2μL无DNase和RNase水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测普氏立克次体的RPA专用引物，是根据普氏立克次体特异性保守序列设计的，所述普氏立克次体特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列SEQ ID NO.1：AAACAGGAAATTAATTCTATTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAGAATCACAACAGTTTAAAAAAACTAAAAGTCTAGAAGATATAGAAGATGGATCTTTATCATCACAATTAAAGCAAACTAAATATAAATCGGTGTTATCACCTTCTTCTTATGTTAACGACATGTTTAGTAATGAGCATCATCAAAACTCTAGCATTGAACTACCAAAGTTGTTGCATAGTTCATTGAGTGATACGAACAGTTCGCTTAATGATTGTATAAATCAACTACGATGTGCAAATACATCAGATGTATATAATTTATCATATACACTTTCAAATAAAACAAAGCAATTAAGTATTGATGAACTCAAAAATACATTAGAACAAATGCAAACTTCTCCTAATATAAATATAGTATTGCCTATGCTAATTAGAGTACAACAAGATTATGTAAATGAGGTTGCTGAAATATACCAGCAGACTATAGAACAAAGAAAGCAAAACCCAAGTGAGCAGGCAAAAAATCAAGAAGAGGTAGTAGCAGCTTACTTTACTCAAGAATACGATAAACTA 。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测普氏立克次体的RPA专用引物，是根据普氏立克次体特异性保守序列设计的，所述普氏立克次体特异性保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列SEQIDNO.1：AAACAGGAAATTAATTCTATTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAGAATCACAACAGTTTAAAAAAACTAAAAGTCTAGAAGATATAGAAGATGGATCTTTATCATCACAATTAAAGCAAACTAAATATAAATCGGTGTTATCACCTTCTTCTTATGTTAACGACATGTTTAGTAATGAGCATCATCAAAACTCTAGCATTGAACTACCAAAGTTGTTGCATAGTTCATTGAGTGATACGAACAGTTCGCTTAATGATTGTATAAATCAACTACGATGTGCAAATACATCAGATGTATATAATTTATCATATACACTTTCAAATAAAACAAAGCAATTAAGTATTGATGAACTCAAAAATACATTAGAACAAATGCAAACTTCTCCTAATATAAATATAGTATTGCCTATGCTAATTAGAGTACAACAAGATTATGTAAATGAGGTTGCTGAAATATACCAGCAGACTATAGAACAAAGAAAGCAAAACCCAAGTGAGCAGGCAAAAAATCAAGAAGAGGTAGTAGCAGCTTACTTTACTCAAGAATACGATAAACTA。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物中的正向引物具有SEQIDNO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin）SEQIDNO.2：5’TTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAG3’SEQIDNO.3：5’GTTCGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，齐永，邵银秀，尹琼，王长军，李素芹，陈红霞，饶继先，李佳萌，胡志斌，陈乐如，郭峻，杨彬彬，
申请(专利权)人：李佳萌，
类型：发明
国别省市：江苏,32