一种检测恙虫病东方体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、其专用引物和探针及用途技术

本发明专利技术提供了用于检测恙虫病东方体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在恙虫病东方体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针是基于恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因保守序列设计，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术首次将新型恒温扩增技术RPA应用于恙虫病东方体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在25‑43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。本发明专利技术具有高灵敏度、高特异性，且对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测等优点，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测恙虫病东方体的重组酶聚合酶恒温扩增方法、其专用引物和探针及用途
本专利技术属于生物
，涉及恙虫病东方体的分子生物学，涉及一种检测恙虫病东方体的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测恙虫病东方体的方法、其专用引物和探针及其用途。
技术介绍
恙虫病东方体（Orientiatsutsugamushi，Ot），原称为恙虫病立克次体，属变形菌纲α亚群立克次体目立克次体科立克次体属。为恙虫病的病原体，是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。恙虫病东方体可引发人类恙虫病，以鼠类为主要传染源，经恙螨幼虫叮咬而传给人。主要流行于我国的东南与西南地区，近年来恙虫病发病率上升，并有自然疫源地扩展的趋势。恙虫病临床上以突发高热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大、皮疹为特征，有的伴有肺炎、脑膜炎等多种并发症，严重者可致多脏器衰竭甚至死亡。由于该病与其他热性病临床症状相似，且对常规青霉素类等抗生素不敏感，加上目前医院普遍未建立针对该病的特异性检测方法，临床上极易造成误诊，导致延误治疗甚至死亡。目前，对恙虫病东方体的检测方法主要包括过非特异的Giemsa染色法、特异的免疫荧光抗体染色法、酶联免疫法、荧光定量PCR法等。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的恙虫病东方体的检测方法有重要意义。近年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDxInc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25-43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测恙虫病东方体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测恙虫病东方体的检测方法。因此本专利技术的第一个目的是提供用于检测恙虫病东方体的引物，包括正向引物和反向引物，共两条。所述引物是根据恙虫病东方体的保守基因56kDa外膜蛋白基因（GenBank:KM115577）设计的，该基因含有730个碱基的核苷酸片段，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选地，所述引物的长度为30bp以上。优选地，所述引物包括正向引物OtF299和反向引物OtR583，共两条，分别位于56kDa外膜蛋白基因（GenBank:KM115577）第299至328核苷酸位点之间和第554至583核苷酸位点之间，具有如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，其中反向引物5’端标记生物素（Biotin）。正向引物和反向引物扩增完成后获得的双链DNA将标记有生物素。用于恙虫病东方体的RPA专用引物，是根据恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因（GenBank:KM115577）序列设计的，所述恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。SEQIDNO.1：AGAGCAGAGCTAGGGTTTATGTACCTTAGAAATATAAGCGCTGAGGTTGAAGTAGGTAAAGGCAAGGTTGAAGTAGGTAAAGGTAAGGCAGATTCTGGAGGTGAGATAAAGGCAGATTCTGGAGGTGGGACAGATGCTCCTATTATACGTAAGCGGTTTAAACTTACACCTCCTCAGCCTACTATAATGCCTATAAGTATAGCTGATCGTGACCTTGCGGTTGATATTCCTAACATACCTCAGGCGCAAGCGCAAGCTGCAAATCCTCAGCTTGATCATGAGCAACGTGCTGCAGCTAGGATCGCTTGGTTAAAGAATTGTGCTGGTATTGACTATAGGGTAAAAGATCCTAATAATCTTAATGGGCCTATGGTTATAAATCCGGTGTTGTTAAATATTCCACAGGGTAACCCTAATCCTGTTGGAAATCCACCGCAGCGAGCAAATCAGCCTGCAGATTTTGCGATACATAACCATGAGCAATGGAGGTATATGGTAATTGGACTTGCTGCATTATCAAATGCTAATAAACCTATCGATCCTCCTGTCAAAGTATTAACTGATGAAATTACTCAGAGGAAGGATGAAGTAAGGCCACATGCCGATATAGTCGGTATTGAAGTTCCTAATACTGCTTTGCCTAATAGTGCATCTGTCGAACAGATACAGAATAAAATGCAAGAATTAGGCGAGGTATTAGAAGAGCTCAGAGATTTTTTTGATGGGTATA。所述引物中的正向引物具有SEQIDNO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQIDNO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin）。SEQIDNO.2：5’GGATCGCTTGGTTAAAGAATTGTGCTGGTA3’SEQIDNO.3：5’CCTTCCTCTGAGTAATTTCATCAGTTAATA3’。用于检测恙虫病东方体的RPA探针，是根据恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因（GenBank:KM115577）序列设计的，所述恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。该探针位于56kDa外膜蛋白基因第397至442核苷酸位点，具有SEQIDNO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）。SEQIDNO.4：5’ATTCCACAGGGTAACCCTAATCCTGTTGGAATCCACCGCAGCGAG3’。所述探针由荧光素、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团组成。所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC等其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。一种用于检测恙虫病东方体的RPA方法，包括使用引物SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和探针SEQIDNO.4。所述用于检测恙虫病东方体的RPA方法中用于50μL的RPA反应体系的试剂，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为10μmol/L，所述的探针的浓度为5μmol/L，镁离子浓度为280μmol/L，模板加样量为1μL。将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase和RNase水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmpnfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上。将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于恙虫病东方体的RPA专用引物，是根据恙虫病东方体56kDa 外膜蛋白基因保守序列设计的，所述恙虫病东方体56kDa 外膜蛋白基因保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；SEQ ID NO.1：AGAGCAGAGCTAGGGTTTATGTACCTTAGAAATATAAGCGCTGAGGTTGAAGTAGGTAAAGGCAAGGTTGAAGTAGGTAAAGGTAAGGCAGATTCTGGAGGTGAGATAAAGGCAGATTCTGGAGGTGGGACAGATGCTCCTATTATACGTAAGCGGTTTAAACTTACACCTCCTCAGCCTACTATAATGCCTATAAGTATAGCTGATCGTGACCTTGCGGTTGATATTCCTAACATACCTCAGGCGCAAGCGCAAGCTGCAAATCCTCAGCTTGATCATGAGCAACGTGCTGCAGCTAGGATCGCTTGGTTAAAGAATTGTGCTGGTATTGACTATAGGGTAAAAGATCCTAATAATCTTAATGGGCCTATGGTTATAAATCCGGTGTTGTTAAATATTCCACAGGGTAACCCTAATCCTGTTGGAAATCCACCGCAGCGAGCAAATCAGCCTGCAGATTTTGCGATACATAACCATGAGCAATGGAGGTATATGGTAATTGGACTTGCTGCATTATCAAATGCTAATAAACCTATCGATCCTCCTGTCAAAGTATTAACTGATGAAATTACTCAGAGGAAGGATGAAGTAAGGCCACATGCCGATATAGTCGGTATTGAAGTTCCTAATACTGCTTTGCCTAATAGTGCATCTGTCGAACAGATACAGAATAAAATGCAAGAATTAGGCGAGGTATTAGAAGAGCTCAGAGATTTTTTTGATGGGTATA 。...

【技术特征摘要】
1.一种用于恙虫病东方体的RPA专用引物，是根据恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因保守序列设计的，所述恙虫病东方体56kDa外膜蛋白基因保守序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；SEQIDNO.1：AGAGCAGAGCTAGGGTTTATGTACCTTAGAAATATAAGCGCTGAGGTTGAAGTAGGTAAAGGCAAGGTTGAAGTAGGTAAAGGTAAGGCAGATTCTGGAGGTGAGATAAAGGCAGATTCTGGAGGTGGGACAGATGCTCCTATTATACGTAAGCGGTTTAAACTTACACCTCCTCAGCCTACTATAATGCCTATAAGTATAGCTGATCGTGACCTTGCGGTTGATATTCCTAACATACCTCAGGCGCAAGCGCAAGCTGCAAATCCTCAGCTTGATCATGAGCAACGTGCTGCAGCTAGGATCGCTTGGTTAAAGAATTGTGCTGGTATTGACTATAGGGTAAAAGATCCTAATAATCTTAATGGGCCTATGGTTATAAATCCGGTGTTGTTAAATATTCCACAGGGTAACCCTAATCCTGTTGGAAATCCACCGCAGCGAGCAAATCAGCCTGCAGATTTTGCGATACATAACCATGAGCAATGGAGGTATATGGTAATTGGACTTGCTGCATTATCAAATGCTAATAAACCTATCGATCCTCCTGTCAAAGTATTAACTGATGAAATTACTCAGAGGAAGGATGAAGTAAGGCCACATGCCGATATAGTCGGTATTGAAGTTCCTAATACTGCTTTGCCTAATAGTGCATCTGTCGAACAGATACAGAATAAAATGCAAGAATTAGGCGAGGTATTAGAAGAGCTCAGAGATTTTTTTGATGGGTATA。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述引物中的正向引物具有SEQIDNO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQIDNO.3所示的寡核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，齐永，尹琼，邵银秀，沈红兵，李素芹，曹勇平，陈红霞，饶继先，王长军，李佳萌，陈乐如，徐亭亭，郭峻，操敏，
申请(专利权)人：李佳萌，
类型：发明
国别省市：江苏,32