一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用制造技术

本发明专利技术一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。是一种用于传染病检测的基因芯片，对流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、Ｏ１５７：Ｈ７引起的出血性肠炎等７种主要传染病进行检测、分型或鉴定毒株。分别从流行性出血热病毒的Ｓ基因、东方立克次体的５６ＫＤ蛋白基因、钩端螺旋体的２３ＳＲＮＡ基因、血吸虫的５Ｄ抗原基因、疟原虫的ＳＳｒＲＮＡ基因、大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的Ｏ１５７抗原基因、Ｈ７抗原基因及毒素基因、霍乱孤菌的外膜ＯＷＰ蛋白基因及毒素基因内选择特异性的基因探针和ＰＣＲ引物。其特征在于芯片包括（１）多种传染病的多种检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针；（２）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用涉及的
是医学检验和基因芯片技术。是一种用于传染病检测的基因芯片，对流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、0157H7出血性肠炎7种主要传染病进行检测并分型或鉴定毒株。因此，对这些病原体快速检测并确定型别不仅有重要的临床价值，为及时有效地预防、治疗和控制传染病提供依据，而且对保障群众身体健康和确保部队的生存力和战斗力，以及反生物恐怖等均有重要意义。目前对上述7种重要传染病的检测方法主要基于对病原体的培养、毒素检测、血清学(抗原或抗体)检测，但这些检测方法均不适合早期快速检测，难于适应军事斗争的需要，并且不易分型。如细菌的培养需要数天甚至数周的时间，疟原虫和钉螺的镜检费时费力，漏检率高。酶联免疫技术、免疫胶体金法、免疫荧光技术、放射免疫技术等免疫学方法具有快速、特异等优点，但大多要求在感染一定时间后才能侦检，以及操作仍然比较复杂，或敏感性较低，或应用范围狭窄，也不能分型等，往往只适合于流行病学调查。虽然近年来也发展了PCR技术及DNA探针杂交技术，但仍存在特异性和敏感性等方面的问题。常规PCR技术大多数限于单一病原体型别的临床诊断，同时存在易被污染和特异性问题，也难于适应大规模、高通量和平行检测的要求。DNA探针杂交技术，在检测的特异性方面有所提高，但操作步骤繁琐，所需时间较长。基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。DNA芯片的制备方法主要有两种一种是在直接在固定面上原位化学合成一系列寡核苷酸，另一种将预先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式点样、固定在固相面上。制备好的芯片通过化学处理后即可进行杂交反应，利用激光共聚集显微扫描技术判定杂交结果。病原微生物，包括细菌、病毒的基因组序列已经逐步测出，为其分析提供了一个很好的切入点，而基因芯片又为检测和平行研究病原微生物提供了有力的工具。将基因芯片技术用于疾病的诊断已成为全球研究的热点，并已研制成功检测部分病毒等微生物的基因芯片。基因芯片技术用于疾病诊断的优点有以下几个方面一是高度的灵敏和准确性，用样本极少；二是快速简便、时间短；三是可同时检测多人的多种疾病。鉴于生物芯片技术具有巨大的理论意义和实际应用价值，我国一些科研实力较雄厚的单位已开展了这方面的研究工作。然而，国内实用性芯片研究多刚刚起步，截至目前，国内外尚未见用于针对我国这7种重要传染病(流行性出血热、霍乱、大肠杆菌0157H7、疟疾、恙虫病、钩端螺旋体、血吸虫)的快速检测的基因芯片。流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌0157H7)仍然是我国易发生流行的主要传染病，尤其是在自然灾害(如水灾)后、大部队集结以及其它突发情况下，严重威胁人类健康，常常危及生命和造成社会恐慌。如血吸虫和疟疾等虽然防治工作取得很大进展，但近年来有回潮现象。建立一种快速检测这7种传染病的基因芯片，对于传染病的控制、预防和治疗，有着重大的社会应用前景和军事意义。本专利技术主要针对东南沿海存在的7种主要传染病(流行性出血热、霍乱、大肠杆菌0157H7、疟疾、恙虫病、钩端螺旋体、血吸虫)，通过分析筛选这7种疾病病原体的DNA序列，分别设计不同的寡核苷酸片段，建立了包括检测及鉴定基因芯片技术在内的综合分析检测方法，以期达到快速、准确、特异的检测目的，并进行了应用。同时，根据传染病流行和爆发的特点，研究制订了这7种主要传染病的有效、实用的紧急预防和处理措施。除研制出7种主要疫病检测及分型基因芯片和建立了突发情况下传染性疫病的紧急预防和处理措施，还为更多的传染性疾病的分子生物学检测和鉴定以及防制建立了理论和技术基础。一种检测多种传染病的检测型基因芯片，其特征在于芯片包括(1)多种传染病的多种检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针；(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；所谓的多种传染病的检测型基因芯片是指检测流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌0157H7)七种病的寡核苷酸阵列；所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚核苷酸，长度在十到五十个碱基；所谓的检测寡核苷酸探针是指化学合成的多种重要传染病病原体的基因保守区、毒力因子序列、基因型及亚型的互补的寡聚核苷酸，毒力因子序列探针包括了病原体致病所必须的多种基因序列的探针，基因型及亚型决定区的探针包括多种基因型和和多种亚型探针；所谓的质量控制探针至少包括二种探针，即阳性对照，阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位；所谓的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；所谓的寡核苷酸探针固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时，与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键。该检测型基因芯片特征在于流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌0157H7)七种病每种病原体靶基因选择有1-4个毒力序列探针或亚型特异性探针，并且根据需要添加其它突变探针和其它相关病原体的探针，探针包括了寡核苷酸探针和肽核酸探针。设计了多组对多种传染病病原体靶基因进行诊断、检测、分型和流行病学调查的高特异性的扩增引物，其设计原则为每一个引物必须在对应病原体靶基因的高度特异性部位，每对引物的扩增区域为病原体靶基因特征序列或毒力必须序列，尽可能包括分型所需的亚型特异性序列；引物包括了针对芯片检测所需的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、多重聚合酶链反应(PCR)、常规PCR、不对称PCR等的特异性引物，每一对特异性引物能够扩增出基因库GeneBank中所有同种病原体的基因片断。这些探针的固相载体材料包括多种方法处理的玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜和其它高分子聚合物制成的膜及片等。这些固相载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰，常用的具有双活性基团的长链有机化合物试剂有戊二醛、三羟甲基氨基硅烷(APTES)、N，N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸，可采用其中的一种或其中的两种的组合。扩增的PCR产物可通过标记荧光素Cy3、荧光素Cy5、生物素的引物进行标记等，也可在基因扩增过程中加入荧光素Cy3、荧光素Cy5、生物素等标记的dUTP或dCTP。该检测型基因芯片，能在流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌0157H7)的检测、分型、诊断、传染病监测、流行病学调查、查明传染病病原体种类及鉴定中应用。该检测型基因芯片可用于一种或多种传染病病原体的检测，包括流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌0157H7)及它们的任意组合。我们在查阅历年来大量文献的基础上，并参考了国内外关于这7种传染病检测的最新进展，检索并研究了7种病病原体的基因序列(包括不同亚型和突变型)，确定了分别要扩增的靶基因，用Clustal W软件找出特定病原体靶基因序列的各亚型间共同的高度保守区和不同亚型的各自特异性序列，结合了Prime本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测多种传染病的检测型基因芯片，其特征在于芯片包括（１）多种传染病的多种检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针；（２）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；所谓的多种传染病的检测型基因芯片是指检测流行性出血热、恙虫 病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎（大肠杆菌０１５７∶Ｈ７）七种病的寡核苷酸阵列；所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚核苷酸，长度在十到五十个碱基；所谓的检测寡核苷酸探针是指化学合成的多种重要传染病病原体的基 因保守区、毒力因子序列、基因型及亚型的互补的寡聚核苷酸，毒力因子序列探针包括了病原体致病所必须的多种基因序列的探针，基因型及亚型决定区的探针包括多种基因型和多种亚型探针；所谓的质量控制探针至少包括二种探针，即阳性对照，阴性对照；阴性对照 用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位；所谓的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；所谓的寡核苷酸探针固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时，与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共 价键。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陶开华，李越希，张锦海，
申请(专利权)人：陶开华，李越希，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]